双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (高通量）说明书

双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (高通量）说明书

产品详情

产品描述

报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控，萤火虫萤光素酶 和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence)，这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围，同时检测的灵敏度高，可达到 10-20mol。两种催化反应最适浓度不同，因此互不干扰， 配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统，其中海肾萤光素酶常作为内参照。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61 kDa 的蛋白，在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此过程中会发出波长约为 560 nm 的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为 36 kDa 的蛋白，在氧气存在的条件下，催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide，在此过程中会发出波长约为 480 nm 的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时，可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化 luciferin 的发光，而不干扰海肾萤光素酶的活性，从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或)或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系，可以高效、灵敏地检测基因的表达。检测原理如图所示：

图 1.荧光素酶报告基因反应原理图

产品组成

试剂盒组分：

运输与保存

冰袋运输，-20℃保存 6 个月，-80℃保存更长时间。

实验步骤

1. 试剂准备：

（1）1x Universal lysis Buffer（ULB）配置：取所需体积的 5x Universal lysis Buffer 临用前用三蒸水稀释至1x；

（2）Fluc buffer A 工作液：试剂盒开始启用时，将 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中，适当吹打摇匀至粉末充分溶解后，分装到棕色管中-20℃保存备用；

（3）Rluc Buffer B 工作液：临用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀释至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 内使用有效（试剂配置过程中注意避光）。

2. 细胞裂解:

（1） 细胞裂解：取出孔板放置至恢复室温，加入适量体积 1x ULB 振荡器摇匀，室温裂解 15min。细胞裂解液推荐使用量：

（2） 荧光酶标仪设定，正确开启仪器，点击检测，选择生物发光检测功能，根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积分时间，默认为增益 135，积分时间 10 s。

3. 检测：

1)移液枪吹打混匀裂解液后，吸取 20 μL 到黑色孔板底部。（样品数量过多时候建议使用移液枪经转移和后续加液操作，若使用四周不透光的培养板可省略转移操作）

2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A，轻柔快速吹打混匀三次后，室温孵育反应 5-10min 后，上机检测记录发光值（F 值）。

  3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B，轻柔快速吹打混匀三次后，室温孵育反应 5-10min 后，上机检测记录发光值（R 值）。

（为保证结果准确性，在加入 Fluc buffer A 或Rluc buffer B 后，请在 1h 内完成检测）

实验案例分析

在 96 孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态，第二天进行如下转染：1.含有FXR 基因启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒；2.含有 FXR 基因启动子区转录因子 E2 功能的重组表达载体质粒；3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染 6h 向每孔中加入不同单体药物培养 48h，其中设置空白溶剂 DMSO 组。最后按试剂盒说明书操作裂解随后进行荧光素酶报告基因活性检测，结果如下（对应孔中所标白色字体数值为阳性激动剂的激动倍数）

图 3 . 59 种单体药物对X 基因启动子区荧光素酶报告基因激动倍数热图（A1:为空白溶剂对照组；A2-J6: 59

种 FDA 上市药物的实验组）

经过上述实验的高通量筛选确定 F3 孔对应单体药物对FXR 启动子区激动效果强，激动倍数为 45。同某进口“P“品牌一同测定该药物对FXR 基因的激动曲线，并计算 EC₅₀，结果如下：

图 4.红色：金畔生物品牌测定 F3 单体药物激动 FXR 基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线；黄色：进口“P“品牌测定F3 单体药物激动 FXR 基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线（EC50）

1. 数据分析：

（1）实验设计：根据实验目的，每组实验均应设置空白对照组，对照组和处理组。

a. 空白对照组

背景 F：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白对照组样品量须与实验样品量相同，且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。

b. 对照组：转染细胞未经实验因素处理 (即对照组 F 和对照组 R)。

c. 实验组：转染细胞经实验化合物处理 (即实验组F 和实验组 R)。

计算结果：对照组比值=(对照组 F-背景 F)/(对照组 R-背景 R)，实验组比值=(实验组 F-背景 F）/(实验组 R-背景 R)。

表达倍数= 实验组比值/对照组比值。

注意事项

（1） 反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温（20–25℃）。

   （2） 检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光酶标板。

（3） 发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，应确保同组内不同样本检测条件一致。

（4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

    （5） 本产品仅作科研用途！