Cell Meter 细胞自噬检测试剂盒 蓝色荧光

简要概述

        Cell Meter 细胞自噬检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测细胞自噬的试剂盒，自噬是一种进化上保守的降解过程，其靶向长寿命蛋白质，细胞器和其他细胞质成分，通过溶酶体途径降解。自噬途径与遍在蛋白 – 蛋白酶体途径的作用互补，其通常降解短寿命蛋白质。多重细胞作用需要激活自噬途径，包括饥饿期间的存活，细胞内组分的清除，发育和免疫。在没有压力的情况下，自噬具有管家功能，去除受损的细胞器和细胞成分，防止细胞毒性作用。自噬的减少和缺陷与多种疾病有关，例如Huntingtons，Alzheimers和Parkinsons。就癌症发展而言，自噬似乎扮演着多重角色。某些自噬蛋白（如Beclin-1和Bif-1）的表达减少或缺失会增加小鼠的肿瘤易感性，而这些蛋白的过表达可抑制癌细胞的生长。然而，自噬对于实体瘤的营养不良和缺氧核心内的癌细胞的存活是至关重要的。 Cell Meter 自噬试剂盒使用Autophagy Blue 作为特异性自噬体标记来分析自噬的活性。该测定被优化用于直接检测分离和附着细胞中的自噬。该试剂盒为分析方案提供了所有必需的组分。 Cell Meter 自噬试剂盒适用于荧光显微镜，荧光酶标仪和流式细胞仪。 Autophagy Blue 在Ex / Em = 333 / 518nm处具有荧光激发和发射。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 细胞自噬检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.用测试化合物制备细胞，密度为1 – 2×10⁴个细胞/孔
2.添加Autophagy Blue 工作溶液
3.在37°C孵育15-60分钟
4.用洗涤缓冲液洗涤细胞
5.监测Ex / Em = 330 / 520nm处的荧光增加（截止= 475nm），使用DAPI滤光片组的荧光显微镜或使用Ex / Em = 330 / 520nm通道的流式细胞仪

工作溶液配制

将20μL500XAutophagy Blue （组分A）加入10 mL染色缓冲液（组分B）中并充分混合以制备Autophagy Blue 工作溶液。 避光。 注意：对于一个96孔板，20μL的500X Autophagy Blue （组分A）就足够了。有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

操作步骤

1.根据您的特异性诱导方案（约1-2×104个细胞/孔/ 96孔板）将细胞培养至 适于自噬诱导的密度。同时，对于每种标记条件，以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。

2.去除培养基

3.向每个孔中加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Autophagy Blue 工作溶液。

4.将细胞在37°C，5％CO₂培养箱中孵育15至60分钟。注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。

5.用洗涤缓冲液（组分C）洗涤细胞3-4次，然后向每个孔中加入100μL洗涤缓冲液（组分C）。注意：如果细胞看起来没有充分染色，建议增加标记浓度或孵育时间以使染料积累。

6.用荧光酶标仪在Ex / Em = 330 / 520nm（截止= 475nm），具有DAPI滤光器组的荧光显微镜或具有Ex / Em = 330 / 520nm通道的流式细胞仪监测荧光强度。

数据分析

Cell Meter 细胞自噬检测荧光成像试剂盒

简要概述

自噬是动物细胞内大分子降解的主要途径之一。 自噬过程涉及将细胞质和细胞内细胞器隔离在称为自噬体的膜结合液泡中，将自噬体与溶酶体融合，然后降解被隔离的物质。 Cell Meter 细胞自噬检测荧光成像试剂盒采用Autophagy Super Blue 作为特异性自噬标记物来分析自噬活性。 该测定法经过优化，可直接检测分离和粘附细胞中的自噬。 Cell Meter 细胞自噬检测荧光成像试剂盒针对荧光显微镜进行了优化。 它提供了比其他市售自噬探针更高的选择性。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 细胞自噬检测荧光成像试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.用您的测试化合物以1-2×10⁴个细胞/孔的密度制备细胞
2.添加自噬Super Blue 工作溶液
3.在37°C孵育15-60分钟
4.用洗涤缓冲液洗涤细胞
5.使用DAPI滤光片组检测在Ex / Em = 330/520 nm（截止= 475 nm）处的荧光

溶液配制

 工作溶液配制

将20μL500X自噬Super Blue （组分A）添加到10 mL染色缓冲液（组分B）中，并充分混合以制成Autophagy Super Blue 工作溶液，避光。 注意：20μL500X自噬Super Blue （组分A）足以容纳一个96孔板。

实验步骤

1.根据您的特定诱导方案将细胞培养至 适合自噬诱导的密度（约1-2×10⁴细胞/孔/ 96孔板）。同时，在每种标记条件下，以与诱导种群相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞种群。

2.除去培养基。

3.在每孔中加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的自噬Super Blue 工作溶液。

4.将细胞在37°C，5％CO₂培养箱中孵育15至60分钟。注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。

5.用洗涤缓冲液（组分C）洗涤细胞3-4次，然后向每个孔中添加100 µL洗涤缓冲液（组分C）。注意：建议增加标记浓度或孵育时间，使染料在细胞未充分染色的情况下积累。

6.用荧光酶标仪在Ex / Em = 330/520 nm（Cutoff = 475 nm）上检测荧光强度，或使用带有DAPI滤光片组的荧光显微镜。

图示

图1.通过自噬在HeLa细胞中诱导自噬Super Blue 标记的囊泡。 将HeLa细胞在常规DMEM培养基（左：对照）中或在含5％血清的1X HBSS缓冲液中（右：自噬处理）孵育16小时。对照细胞和处理过的细胞均在37°C，5％CO2培养箱中与Autophagy Super Blue 工作溶液一起孵育20分钟，并用洗涤缓冲液洗涤3次。 立即在带有DAPI通道（蓝色）的荧光显微镜下对细胞成像。 细胞核用Nuclear Gree LCS1（绿色）染色。