胶原蛋白的分析

新鲜、冷冻和福尔马林固定的组织

介绍

从组织中提取胶原的效率较低且可变，可能是由于成熟胶原中存在交联。因此，定量分析胶原蛋白的

一种常用方法是对组织进行酸水解，然后用HPLC或比色法测定羟脯氨酸。该方法适用于组织和组织提取物。

然而，组织储存的主要方式是作为石蜡包埋的福尔马林固定组织。到目前为止，组织学染色和图像分析是分析石蜡包埋组织的方法。这种方法确实提供了关于组织中胶原蛋白定位的定性信息，但只是半定量的。

我们设计了一种定量和易于分析福尔马林固定石蜡包埋的组织或组织切片中的胶原蛋白的方法。不需要用二甲苯等有毒溶剂去除石蜡，也不需要使用特殊设备。该方法的灵敏度是，仅适用于少量10µm组织切片定量胶原。

在这个应用说明中，我们展示了在新鲜或冷冻组织、福尔马林固定组织和石蜡包埋组织中易于进行每个蛋白分析的数据和方法。

图1.

不同类型组织中总胶原和总蛋白分析示意图

方法

.1该程序的表示形式如图所示。将5-10个10µm组织切片（或相应数量的新鲜或福尔马林固定组织）转移到萨斯特管中，加入150µl6M盐酸，在95时通过o/n孵育水解oC在热块中。

水解后，在不进行任何预处理的情况下，35µl用于胶原定量测定(测定时间90min)， 15µl用于快速酶蛋白测定(测定时间30min)，这是专门用于酸水解物中的蛋白质分析的方法开发的。蛋白质数据被用作用于水解的未知数量的组织的归一化。结果在冷冻组织、石蜡化和脱亲和的组织切片中，胶原蛋白和蛋白质的比例相似样品处理，如甲醛固定、石蜡包埋和二甲苯处理脱除样品，不影响胶原蛋白和蛋白质分析（图2）。

图2.

以不同方式处理的组织中的胶原蛋白/蛋白质比例 在甲醛固定石蜡包埋的人动脉组织中分析胶原蛋白。将冷冻组织、10µm石蜡包埋组织切片或10个经二甲苯预处理的10µm组织切片 水解，并使用快速酶总胶原试验和快速酶蛋白试验进行进一步分析

每个蛋白质的胶原蛋白的结果与每个湿重分析的胶原蛋白相似

每毫克组织湿重的胶原蛋白和每毫克蛋白质的胶原蛋白给出了类似的结果(见表1A和表1B)。因为并不是针对所有的应用程序(例如。当使用福尔马林固定的组织时)，可以确定湿重或干重，酸水解酸中的蛋白质分析为组织中的胶原蛋白分析提供了新的机会。

表1A。不同小鼠组织的每湿重胶原蛋白分析机构

表1B。不同小鼠组织的胶原蛋白分析

从不同类型的（纤维化）组织的切片中提取的胶原蛋白和蛋白质分析从组织切片开始，例如小鼠肾纤维化(UUO)、肺纤维化（博莱霉素诱导）和肝纤维化(NASH)。从10个10µm石蜡包埋切片中测定总胶原蛋白/总蛋白。3)，并被发

现在纤维化条件下增加。

图3在各种纤维化和非纤维化组织中处理的组织中的胶原/蛋白比例

在小鼠肾纤维化(UUOvsSham)肺纤维化(博莱霉素vsPBS)和饮食诱导的NASH(西 方饮食加胆固醇vs对照组)的甲醛固定石蜡包埋组织中分析总胶原蛋白/总蛋白。对10个10µm组织切片进行水解，并使用快速酶总胶原分析和蛋白分析

结论

在新鲜、冷冻或福尔马林固定石蜡包埋组织中，胶原蛋白和总蛋白的定量现在可以以一种快速和简单的检测格式进行，而不需要HPLC或其他特殊设备。QuickZyme生物科学公司开发了一套用于分析任何物种的胶原蛋白的分析方法，每一种都有不同的应用领域胶原蛋白 相关的 化验 可用的 在 激酶 生物科学激酶可溶性胶原蛋白测定

快速Zyme总胶原检测

激酶羟脯氨酸测定

快速zyme蛋白测定

激酶可溶性胶原蛋白测定

该检测方法可识别可溶性或（酸/胃蛋白酶）可溶性胶原蛋白。

该检测方法是比色法，有96孔板格式，并基于胶原蛋白与天狼星红的沉淀。这种染料可以结合碱性氨基酸残基的侧链基团。染料在高pH下从沉淀配合物中释放，然后进行比色检测。基于天狼星红的检测可以识别胶原蛋白，但也有其他一些基质相关蛋白可能共同沉淀。

应用：该测定方法用于测定（可溶性）胶原蛋白。细胞培养基，以及（酸或酸/胃蛋白酶）溶解的胶原蛋白e。g.从 细胞提取物。

quickzyme 总胶原检测

该方法可识别所有类型的胶原蛋白，无论其形式如何（成熟、未成熟、前胶原蛋白、降解胶原蛋白、交联胶原蛋白、来自不同来源的胶原蛋白）。

该检测方法是比色法，具有96孔板格式，并基于羟脯氨酸的定量，这是一种只存在于胶原蛋白中的氨基酸。羟脯安酸在含胶原样品的酸水解后释放出来。水解在95点进行0C，该产品可直接用于羟脯氨酸分析，无需进步洗涤或干燥步骤。该分析是基于已建立的氯胺T/DMBA方法。

应用范围：该测定方法用于测定总胶原蛋白。由于一是样品的*水解，胶原蛋白的提取困难没有任何作 用。该检测方法适用于所有类型的样本，包括组织。

激酶羟脯安酸测定

该测定方法与总胶原测定方法相似，不同之处在于没有包括胶原水解的方案和材料，而没有提供胶原标准

，而是羟脯安酸标准。

应用：该方法与总胶原检测具有相同的应用区域，但适用于有自己的水解方法或有水解样品进行分析的客户。

quickzyme蛋白测定

该方法测定蛋白质水解产生的游离氨基酸。该方法采用比色法，可直接对酸水解物进行。

应用：该方法旨在测量酸水解物中的总蛋白，当不可能进行基于重量的归一化、不方便或变化太大时，提供总 胶原蛋白和羟脯安酸值的归一化。

如何测量小鼠组织中的胶原蛋白？

介绍
胶原蛋白是脊椎动物体内丰富的蛋白质。胶原蛋白的准确分析对于胶原蛋白发挥重要作用的疾病研究以及纯化胶原蛋白在生物医学、化妆品或营养品行业的应用都很重要。
虽然胶原蛋白是人体的主要成分，但它是一种难以纯化和定量的分子。这部分是由于胶原蛋白分子通过不同类型的
交联，使胶原蛋白分子不溶，难以提取。
商用胶原蛋白分析的数量和类型有限。基于用天狼星红沉淀胶原蛋白分子，存在一些可溶性胶原蛋白的检测方法。然而，这种方法似乎不太适用于组织中胶原蛋白的分析。*泛使用的胶原蛋白分析是基于胶原蛋白水解为游离氨基酸，然后用HPLC或比色法测量胶原蛋白特异性羟脯安酸。然而，这些分析方法费时费力，需要特殊设备。为了克服这些缺点，我们最近开发了QuickZyme总胶原蛋白测定法，该法基于酸水解和比色检测的相同成熟原理，但速度更快，无需特殊设备。
在本应用说明中，我们比较了不同的测定方法，以测定各种小鼠组织中胶原蛋白的能力。我们使用QuickZyme总胶原蛋白测定法（酸水解，羟脯安酸比色检测）、HPLC“金标准”法（酸水解，羟脯安酸HPLC检测）和QuickZyme可溶性胶原蛋白测定法（酸/胃蛋白mei提取，天狼星红结合，比色检测）。

方法
处死健康小鼠（C57Bl6，8-10周龄），分离以下组织：肺、肝、肾、脾、心和真皮。此外，我们还以牛肌腱为样本。将组织/器官分为三部分，其中一部分用于湿重测定、干重测定（在冷冻干燥组织后）、在6 M HCl中的酸水解（10 mg湿组织/100µl 6M HCl，最小体积为200µl）以及通过HPLC或使用比色QuickZyme总胶原蛋白测定法定量羟脯安酸。另一部分直接用于湿重测定，然后使用QuickZyme总胶原蛋白测定法进行酸水解和羟脯安酸定量。第三部分用于湿重测定，用0.5 M醋酸/胃蛋白每过夜培养提取胶原蛋白，然后离心，并使用天狼星红可溶性胶原蛋白测定法进行定量。各种化验的化验原理见图1。

图1：。可溶性胶原蛋白测定法（左）、HPLC法总胶原蛋白测定法（中）和比色法总胶原蛋白测定法（右）的测定原理

后果
-通过酸水解，然后通过HPLC或QuickZyme比色法对胶原蛋白进行定量，两者之间的相关性非常好，并产生类似的值

图1：HPLC和羟脯安酸比色分析的比较。数值表示µg胶原蛋白/mg湿组织

水解可以用湿组织进行，也可以用干组织进行，结果相似。

图2：湿组织和干组织中羟脯安酸分析的比较。数值表示µg胶原蛋白/mg组织

-用基于天狼星红的可溶性胶原蛋白分析法分析各种组织中的可溶性胶原蛋白，得出了不同的结果，其值远低于总胶原蛋白的值，许多组织甚至接近检测极限。与QuickZyme总胶原蛋白测定法相比，可溶性胶原蛋白分析法测得的总胶原蛋白水平要低得多，例如肺2.5%，肾10%，脾8%，真皮9%，肌腱3%。低值可能是由于从大多数组织中提取的成熟胶原蛋白不足。
-用不同方法测量的各种组织中的胶原蛋白含量如表1所示。很明显，每个器官的胶原蛋白水平各不相同，肌腱的胶原蛋白含量最高，其次是皮肤、肺、脾、肾、心脏和肝脏。

表1 通过酸水解，然后通过HPLC或QuickZyme比色分析，分析各种组织中胶原蛋白的近似量（每毫克湿重组织中含有µg胶原蛋白）。

-组织在6 M HCl（最小体积HCl 200µl）中以100 mg/ml（湿重，湿重/干重比见表3）水解，水解产物用4M HCl稀释，如表2所示，35µl稀释水解产物用于总胶原蛋白分析（根据分析手册中的方案）。如表2所示，使用QuickZyme总胶原蛋白分析的最佳稀释因子因组织而异。确定该稀释系数时，应确保不存在基质效应（如果样品稀释不足，则会发生），且该值符合标准线的范围。

-各种组织的湿重与干重之比介于5.0（肺）和3.5（肌腱和皮肤）之间。湿组织或干组织中的胶原蛋白分析得出了类似的结果（数据未显示）。
-在肝组织水解物中，由于稀释程度较低的样品中出现基质效应，稀释因子为5-10。这导致OD值较低（接近或低于标准线中的低浓度）。因此，对于这种类型的组织，我们开发了一种改良的胶原蛋白分析方法，在该方法中未观察到基质效应，因此不需要稀释水解物（见第7页的说明，QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析）。

 结论
•每个组织的胶原蛋白含量不同：肌腱>皮肤>肺>肾>脾>心脏>肝脏
•基于天狼星红的胶原蛋白分析不太适合组织中的胶原蛋白分析，可能是因为从组织中提取的胶原蛋白有限
•定量组织中胶原蛋白的最佳方法是充分水解组织，然后通过HPLC或比色法分析羟脯氨酸
•QuickZyme总胶原蛋白分析非常适合组织中的胶原蛋白分析，结果与HPLC相似，但快速、简单，不需要特殊设备。
•对于胶原蛋白含量低、基质效应大的组织样品，我们开发了QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析。

QuickZyme Biosciences已开发了一系列用于分析任何物种胶原蛋白的分析方法，每种方法都有不同的应用领域
QuickZyme Biosciences提供胶原蛋白分析：
•QuickZyme可溶性胶原蛋白分析
•QuickZyme总胶原蛋白测定
•QuickZyme羟脯安酸测定
•QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析
•QuickZyme敏感组织羟脯安酸测定

QuickZyme可溶性胶原蛋白测定
该分析可识别可溶性或（酸/胃蛋白每）可溶性胶原蛋白。该分析为比色法，采用96孔板格式，基于胶原与天狼星红（一种含磺酸基的阴离子染料）的沉淀。这种染料可以结合碱性氨基酸残基的侧链。染料在高pH下从沉淀的络合物中释放，然后进行比色检测。该分析经过优化，以使其他蛋白质（如白蛋白）不会干扰。明胶（未折叠的胶原蛋白）不被该分析所识别。
应用：该方法用于测定细胞培养条件培养基中的可溶性胶原蛋白和细胞提取物中的可溶性胶原蛋白（酸或酸/胃蛋白每）。由于组织中成熟胶原蛋白的提取效率非常低，因此该方法不太适合测量组织提取物中的胶原蛋白。
QuickZyme总胶原蛋白测定
该分析可识别所有类型的胶原，无论其形式如何（成熟、未成熟、前胶原、降解胶原、交联胶原、各种来源的胶原）。
该分析为比色法，采用96孔板格式，并基于羟脯安酸的定量，羟脯氨酸是一种仅存在于胶原蛋白中的氨基酸。含胶原蛋白样品经酸水解后，羟脯安酸从胶原蛋白中释放出来。水解在950C下进行，产品可直接用于羟脯安酸分析，无需洗涤或干燥步骤。该分析基于已建立的氯胺T/DMBA方法。
用途：该方法用于测定总胶原蛋白。这包括所有胶原类型和形式，例如：前胶原、未折叠胶原、成熟胶原以及样品中所有胶原类型的胶原降解产物。由于第一步是样品的*水解，提取胶原蛋白的困难不起作用。该分析适用于各种类型的样品，包括组织。

QuickZyme敏感组织胶原测定
用羟脯安酸比色法测定组织样本中的胶原蛋白时，一个常见的并发症是出现所谓的基质效应，这是由样本中未识别的成分引起的。矩阵效应可能导致错误的高值或低值。可以通过稀释样品来防止基质效应。然而，这种稀释会导致样品的有效灵敏度较低，这对于小型
胶原蛋白含量低的样品。
与其他基于羟脯氨酸的分析相比，QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析没有基质效应，也不需要稀释水解物，从而能够在低胶原蛋白浓度的小样本中进行测量。该方法简单，不需要酸水解后的干燥步骤，通常需要特殊设备。
应用：该方法用于测量组织样本中的胶原蛋白，尤其是低胶原蛋白含量的组织，如肝脏。
QuickZyme羟脯安酸测定
该测定方法与总胶原蛋白测定方法相似，不同之处在于没有胶原蛋白水解的方案和材料，也没有胶原蛋白标准，但提供了羟脯安酸标准。
应用：该分析与总胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的水解方法或收集水解样品进行分析的客户。
QuickZyme敏感组织羟脯安酸测定
该测定方法与敏感组织胶原蛋白测定方法相似，不同之处在于没有胶原蛋白水解的方案和材料，也没有胶原蛋白标准，但提供了羟脯安酸标准。
应用：该分析与敏感组织胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己水解方法或收集水解样品进行分析的客户。

如何选择您的胶原蛋白检测试剂盒？

胶原蛋白是脊椎动物体内丰富的蛋白质，约占全身蛋白质的30%。它们在组织结构中起着重要作用，并具有许多其他功能，如细胞生长、分化、组织修复和许多病理条件。
胶原蛋白是一个细胞外基质蛋白家族；在脊椎动物中，至少鉴定出27种胶原类型，具有42条不同的多肽链。I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型、XXVII型胶原是形成原纤维的胶原，含有三重螺旋结构，能够捆绑成原纤维。
胶原的特点是存在稳定胶原三螺旋所需的羟脯氨酸残基。
一些胶原的组织分布有限，例如II、IX和XI型胶原几乎只存在于软骨中，IV型胶原的存在仅限于基底膜。I型、II型和III型胶原是组织中含量丰富的胶原。
虽然人体中存在超过3公斤的胶原蛋白，但胶原蛋白是一种难以纯化和分析的分子。这部分是由于胶原蛋白分子通过不同类型的交联形成了广泛的网络，这使得胶原蛋白分子不可溶且难以提取。

目前，对于胶原蛋白的分析，存在各种类型的分析方法：
-ELISA检测胶原特异性前体结构域
-ELISA检测特定类型的胶原蛋白
-利用特异性胶原抗体进行蛋白质印迹
-组织切片天狼星红染色
-基于天狼星红的可溶性胶原蛋白分析
-样品水解后羟脯氨酸残留的测定（通过比色试剂盒或HPLC）。
QuickZyme Biosciences开发了一套分析胶原蛋白的方法，无论是从任何物种和任何组织中可溶的还是不溶的。
QuickZyme Biosciences提供胶原蛋白分析
•QuickZyme可溶性胶原蛋白分析
•QuickZyme总胶原蛋白测定
•QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析
•QuickZyme羟脯氨酸测定
•QuickZyme敏感组织羟脯氨酸测定

QuickZyme可溶性胶原蛋白测定
该分析可识别可溶性或（酸/胃蛋白酶）溶解的纤维状胶原蛋白。
该分析为比色法，采用96孔板格式，基于胶原与天狼星红（一种含磺酸基的阴离子染料）的沉淀。染料在高pH下从沉淀的络合物中释放，然后进行比色检测。对测定进行了优化，使其他蛋白质（如白蛋白）不会干扰。明胶（变性胶原蛋白）不被该分析所识别。该试验需要可溶性或可溶性的原纤维胶原。
应用：该方法用于测定细胞培养基中的可溶性胶原蛋白和细胞提取物中的可溶性胶原蛋白（酸或酸/胃蛋白酶）。化验不是胶原蛋白分析：哪种化验可以用于什么应用？
建议用于组织，因为大多数组织胶原蛋白是交联的和不溶的。

QuickZyme总胶原蛋白测定
该分析可识别所有类型的胶原蛋白（成熟、未成熟、前胶原、降解胶原蛋白、交联胶原蛋白、各种来源和种类的胶原蛋白）。
该分析为比色法，采用96孔板格式，并基于羟脯氨酸的定量，羟脯氨酸是氨基酸脯氨酸的一种改良版本，几乎只存在于胶原蛋白中。含胶原蛋白样品经酸水解后，羟脯氨酸从胶原蛋白中释放出来。水解在95℃下进行，水解产物可直接用于羟脯氨酸分析，无需洗涤或干燥步骤。
应用：该方法用于总胶原蛋白的定量。这包括所有前胶原、未折叠胶原、成熟胶原以及样本中所有胶原类型的胶原降解产物和明胶。由于第一步是样品的*水解，提取胶原蛋白的困难不起作用。该分析适用于所有类型
样本，包括任何物种的组织。由于组织样品中的未知物质，该分析受到基质效应的影响。在许多样品中，可以通过稀释水解物来防止这种影响。如果由于胶原蛋白浓度较低（例如在肝组织中），因此不需要充分稀释水解物，我们建议使用敏感组织
胶原蛋白测定QuickZyme羟脯氨酸测定
该测定与总胶原蛋白测定相似，不同之处在于不包括胶原蛋白水解的方案和试管。
应用：该分析与总胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的水解方法或收集待分析水解样品的客户。
QuickZyme敏感组织胶原测定
该测定法与QuickZyme总胶原蛋白测定法非常相似，但不受基质效应的影响，因此是低胶原蛋白浓度和大量基质效应的肝组织等组织的测定法。
应用：该测定法用于测定（组织）样品中的总胶原蛋白，该样品具有低浓度的胶原蛋白和基质效应，需要在QuickZyme总胶原蛋白测定中稀释

QuickZyme敏感组织羟脯氨酸测定
该试验与QuickZyme敏感组织胶原蛋白试验相似，不同之处在于不包括胶原蛋白水解的方案和管道。
应用：该分析与QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的酸水解方法或收集待分析水解样品的客户。