长读长测序技术痛点：DNA提取速度、产量是关键

本文转自测序中国 作者：戴胜 

近年来，Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies、Bionano Genomics和10x Genomics等公司的长读长测序和基因组图谱技术越来越受欢迎。随着相关技术的推广应用，长读长测序技术在快速、高效提取高质量高分子量DNA方面的痛点日益凸显。

长读长测序技术痛点：DNA提取速度、产量是关键

在过去的基因组研究中，人们可能会更多的选择短读长测序。现在，那些新开展的基因测序研究更愿意选择PacBio、Oxford Nanopore、Biona0x Genomics等公司的技术。例如将为地球上所有66,000种脊椎动物物种生成参考基因组的脊椎动物基因组计划(VGP)，就已承诺在研究中使用高通量基因组图谱技术和长读长测序技术。

利用目前已有的许多DNA提取标准方法，如色谱柱法和磁珠法，获得高分子量DNA并不容易。大多数用户终选择的还是非常传统的方法，如琼脂糖包埋纯化，通过将DNA嵌入琼脂糖凝胶中以保护其免受溶液体系剪切力的影响；或者进行苯酚氯方萃取沉淀。这些方法可以提供纯化的长DNA片段，但缺点是速度慢，难以实现规模化生产。

洛克菲勒大学脊椎动物基因组学实验室将为VGP项目提供测序数据，该实验室主任Olivier Fedrigo表示，BioNano的图谱平台需要200Kb及以上的DNA片段，其他技术如PacBio和10x Genomics则可以获取更短的DNA片段，但实验室决定采取一种适用于所有情况的DNA提取方法。DNA片段不仅要非常长，还要非常纯，不存在蛋白质或其他污染物，这对纳米孔测序尤为重要。

目前，该研究团队已经决定使用Bionano的一种琼脂糖凝胶提取试剂盒及方案，该方案可提取超过250Kb的DNA片段，适用于本所有的下游应用，并适用于不同样本类型，包括动物组织、血液、细胞系和植物。但问题在于，该方案流程为7~10天，并且很难实现自动化，产量不足以进行PacBio测序，一旦开始用于VGP的高通量基因组组装就会出现问题。因此研究团队必须调整Bionano的试剂盒，提高DNA产量。

从个体基因组中获取长片段DNA，是进行基因组测序的关键。Bionano和Nanopore等公司获取真正长DNA片段信息主要依赖于DNA的高分子量提取。为了从人的细胞中提取纳米孔测序用的长片段DNA样本，英国伯明翰大学Josh Quick研究员与同事使用了传统的苯酚-氯方制备技术，该技术已经沿用了数十年，可使DNA保持较高的浓度，并在一定程度保持DNA片段的长度。但遗憾的是，这种方法同样难以自动化。人们往往喜欢谈论获得的长read，但那只是为了吸引客户，真正需要关心的N50。重要的是，获得的长片段DNA有多少是可用的？

多家公司已经接受了这项挑战，如Circulomics、Bionano、Sage Science和RevoluGen，其共同目的是开发一种高通量方法，可从不同的样品类型中提取数百Kb和长达Mb的DNA分子。此外，一些学术团体也一直在开发自用的提取方法，以满足研究中的特定需求。下面，我们一起看看这些公司的研究进展。

Bionano Genomics

Bionano 公司一直在开发提取高质量超高分子量DNA的方法。使用的是经过多年研制的琼脂糖凝胶化学试剂，并提供了有关DNA长度的标准。公司内部和第三方合作伙伴都在努力开发更快、更自动化的样本制备方法，并计划在未来的几个月内发布新产品。

改进样品制备方法，首先要以保持DNA完整性的方式收集和储存样本。如果开始使用的样本就很差劲，也就无法提取高质量的DNA。目前，Bionano已经可提供用于冷冻和处理的哺乳动物血液样本的方案，并正在研究其他各种组织样本的处理方案。

在DNA提取方面，Bionano正在投资不使用琼脂糖凝胶的替代样本制备方案和试剂盒，其速度更快且是自动化的。据悉，该试剂盒可提取高纯度的DNA，平均片段长度为250Kb以上。同时，该公司正在研究新的解决方案和杂质去除方法。目的是即在相同工作流程时间内（几小时内），达到NGS测序的DNA提取标准。许多用户会对快速且不需要贵重设备的提取试剂盒感到满意，自动化将有助于其扩展到一次进行更多样本的检测应用。

Circulomics

Circulomics公司一直与Bionano合作开发新的DNA提取技术。该公司开发了一种Nanobind技术，其原理类似于常规的磁珠提取DNA ，但该技术不会使用数百万的小颗粒，而是利用具有纳米结构二氧化硅表面的小磁盘与DNA结合，其表面会保护DNA不被剪切。在不同的仪器类型中使用，Nanobind可在半小时内处理12到96个样本，可在1小时左右获得数百Kb的DNA片段。Nanobind有一个自动化版本，可在赛默飞世尔科技的KingFisher平台运行。

通常情况下，DNA分子必须被剪切到合适的尺寸才能更好的进行测序检测。Circulomics采用两种策略，一种是使DNA长达数百Kb，满足长读长测序要求；另一种是为Bionano等应用产生超高分子量的DNA，以适用于任何提取试剂盒。此外，Circulomics还在开发DNA文库制备纯化方法，同样使用纳米磁盘作为提取工具，但使用不同的化学物质去除短DNA片段、盐或蛋白质。

目前，Circulomics公司销售两种Nanobind DNA提取试剂盒：一种用于细胞、细菌或血液，另一种用于植物细胞核。此外，该公司正在利用研发中的试剂为不常见样本提供定制化DNA提取服务。同时，Circulomics还在开发一种用于组织DNA提取的商业试剂盒，可适用于多种生物和组织样本。这将涉及一些特殊的同质化步骤和杂质去除方法，尚难以实现自动化。

Sage Science

2017年，Sage Science公司推出了一种用于提取高分子量DNA的仪器，名为Sage HLS。该系统采用电泳技术，每次多可处理四个样本，包括细胞、细胞核或球形细胞的悬浮液。整个制备过程需要2~6小时，DNA可保持数Mb大小，并缠绕在样本的琼脂糖壁中。在加入非特异性酶或CRISPR/Cas9复合物后，DNA被切割，并分离纯化。

Sage Science方面表示，Sage HLS的一个主要优点就是，DNA分子不会暴露在粘滞剪切下，因此可以分离出非常高分子量的DNA，大小可达2Mb。此外，研究人员已经在利用Cas介导的系统分离50~400Kb之间的DNA片段，并正努力将范围增大到1Mb。

RevoluGen

英国的RevoluGen是另一家致力于开发高分子量DNA提取新方法的公司。该公司开发了一种名为Fire Monkey的自旋柱试剂盒，其使用的专有技术可确保DNA保持完整，工作流程约为1小时。

RevoluGen方面表示，依赖*的溶液和基质化学成分，在任何环节都不会像其他自旋柱试剂盒那样破坏DNA。Fire Monkey获得的DNA尺寸高达500 Kb，如果是新鲜样本，平均片段大小可大于100 Kb。此外，与其他方法提取的DNA相比，该方法获得的DNA具有较少的缺口，可减少对长读长测序的干扰。

Fire Monkey可以被复用，处理样本数量几乎不受限制。此外，该方法也可通过磁珠技术实现自动化，目前该公司尚未进行相关工作。实现自动化的一个挑战就是，DNA往往长、短片段混合在一起。为了解决这一问题，RevoluGen开发了一种名为Fire Flow的DNA大小分离技术，可在文库制备过程中去除10Kb及以下的DNA片段。

参考资料：

DNA Extraction Remains Bottleneck for Long-Read Techs But Solutions Begin to Emerge