肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖,将它偶联到交联及活化的琼脂糖凝胶上,该填料具有很高的物理化学稳定性。肝素能和凝血因子和其他血浆蛋白,脂蛋白,蛋白质合成因子,作用 于核酸和类固醇受体的酶,所以肝素琼脂糖凝胶可以用于这类物质的纯化。
1 亲和填料特性
*层析柱10mm*20cm,柱床高度5cm,20 °C
2 使用方法
肝素-琼脂糖凝胶 HP 对于不同的样品的亲和力不同,吸附载量取决于流速、pH、缓冲液组成和温度等参数。
2.1 装柱
(1)让所有的材料和试剂均平衡至层析实验的温度。配制缓冲液,对所有的缓冲液进行脱气处理。
(2)检查层析柱所有部件,特别是过滤网,密封圈,螺旋塞是否紧密,玻璃管是否干净和完整。
(3)根据需要量取相应量的凝胶,用去离子水清洗掉 20%乙醇。
(4)将柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位,务必使底端无气泡。
(5)用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内,注意勿使产生气泡。打开柱子出液口,使凝胶在柱内自由沉降,连结好柱子顶端柱头。
(6)打开蠕动泵,让缓冲液用使用时流速的 1.33 倍的流速流过,使柱床稳定(注意压力不要超过填料最大耐压)。
2.2 样品的制备
样品应完全溶解,并且与结合缓冲液的pH值相同。为了避免堵塞层析柱,我们建议通 过0.45μm过滤器进行离心和过滤,以去除细胞碎片或其他颗粒物质。
2.3 平衡色谱柱
用5-10个柱体积的结合缓冲液平衡该柱,直到流出液电导和pH不变。
用于纯化血浆蛋白质的常用结合缓冲液是10-20mM柠檬酸钠缓冲液,pH 7.4。 由于在这些情况下肝素配体充当亲和配体,因此缓冲液中加入低浓度的NaCl以消除非特异性离子 相互作用。 在其他应用中,通常推荐使用10 mM 磷酸钠,pH 7.0或20 mM Tris-HCl,pH 8.0 作为结合缓冲液。
2.4 上样
(1)样品用平衡液配制,样品一定要离心或过滤后上样。盐浓度太大的样品需要处理后再配。
(2)一般情况是让目标产品结合在柱子上,用平衡液洗去杂质和没有结合的蛋白,再选择一种洗脱液洗下目标产品。
2.5 洗脱
不同的样品,吸附和洗脱方法不相同,可以根据相关的文献进行。通常通过增加缓冲液的离子强度来进行洗脱。最常使用1.5-2 M NaCl,KCl或(NH4)2SO4线性梯度或梯度洗脱。
3 在线清洗
先用0.1M Tris-HCl pH7.0缓冲液洗3个柱床体积,然后用0.1M NaOH含2M NaCl流洗3个床体积,最后用20%乙醇洗3个床体积即可。长时间用酸碱洗填料会是填料的吸附能力下降,所以清洗要尽量缩短时间。
4 保存
4-8℃密闭保存。使用完的填料,用纯水彻底冲洗,最后保存在 20%乙醇中,4℃保存。
5 注意事项:
(1)上样之前,样品必须经过膜过滤及去除色素,否则杂质及色素会被吸附到填料上,影响填料的正常使用。所有的缓冲液均需要用 0.45um 的过滤器过滤。
(2)在使用过程中,避免使用高浓度的强酸强碱,酸和碱的浓度应低于 0.1 摩尔。碱会使流速变慢。
(3)不同的样品,吸附和洗脱方法不相同,可以根据相关的文献进行。