淋巴细胞分离方法
淋巴细胞分离简述
作为一种重要的免疫细胞，淋巴细胞的数目及功能状态反应了机体所处的免疫状态，与一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、传染性疾病以及恶性肿瘤等免疫功能障碍有关的疾病有密切关联。因此，研究淋巴细胞的免疫状态对多种疾病的诊断、预防及治疗都有着极为重要的意义。而淋巴细胞分离是研究淋巴细胞功能状态及其在细胞免疫中作用的关键步骤。
淋巴细胞分离来源主要是外周血（或淋巴组织细胞悬液），目前常规的淋巴细胞分离方法有基于淋巴细胞分离液的密度梯度离心法、HES沉降法、以及基于抗原抗体结合的磁珠与流式细胞分离法。本文就现在常用的几种淋巴细胞分离方法及其特点做一简要综述。
1、密度梯度离心法
该方法采用淋巴细胞分离液进行进行密度梯度离心分离得到淋巴细胞。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同从而导致各种细胞具有不同的密度，淋巴细胞分离液即是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液和Percoll淋巴细胞分离液。
1.1. Ficoll-Hypaque密度梯度离心法
Ficoll是一种中性的蔗糖的多聚体，吸水性强，平均分子量为400,000，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。单一的Ficoll溶液分子量大，高浓度时增加粘度易导致细胞聚集，因此常用的Ficoll淋巴细胞分离液采用了降低Ficoll浓度，同时加入泛影葡胺增加密度的Ficoll-Hypaqu混合溶液，其密度在1.077左右，近于等渗，适用于分离外周血淋巴细胞和单个核细胞（PBMC，外周血淋巴细胞和单个核细胞比重为1.075左右）【1】。利用该分离液作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集，红细胞与粒细胞由于密度较大故沉于分层液的底部，淋巴细胞和单核细胞（PBMC）的比重与分层液比重相近，故位于分层液界面上。【2，3】
Ficool淋巴细胞分离液是一种经典的淋巴细胞分离试剂，分离得到的PBMC纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。然而因其固定的密度，故只适用于PBMC、脊髓干细胞、骨髓干细胞的分离。
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MP Biomedicals Lymphocyte Separation Medium – LSM™ 0850494X 100 mL
biomarket LymphoprepTM分离液 1114544 250ml
1.2. Percoll密度梯度离心法：
Percoll成分为硅化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的颗粒，渗透压很低，粘度也很小，不穿透生物膜，对细胞无毒害无刺激，不引起细胞聚集，可形成高达1.3g／ml密度。特别的是percoll的颗粒直径大小不同，可在离心过程中自然形成连续的密度梯度，从而将不同密度的细胞分离出来。而且Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，配置不同浓度（密度）时仅需通过用PBS(1x)或组织培养液稀释即可获得，广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。采用Percoll细胞分离液得到的细胞可直接用于基于荧光标记的细胞分选。【4】
因此，Percoll细胞分离液不仅适用于外周血中PBMC的分离（单个核细胞和淋巴细胞分别处于不同的密度层），而且能将全血中的多种细胞分离出来（各种细胞处于相应的梯度层），还可根据不同实验室需要配置所需的连续密度梯度，分离特定的细胞或亚细胞组分。初步分离得到的PBMC可根据需要不同密度梯度的不连续梯度离心方法进行进一步细胞纯化，如纯化淋巴母细胞和去除死细胞以及富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化。【5】
常用percoll浓度密度换算（Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127）
Percoll浓度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
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供应商 货号 规格
GE 17-0891-01 1 L
GE 17-0891-01 100 ml
1.3. Iodixanol梯度离心法
Iodixanol是一种化学成分为碘海醇（Iohexo1）的白色、高亲水性粉剂，可以配成型的非离子密度梯度分离液。分子量为821，密度为2.1 g/ml，是非离子型的、对细胞无毒性的化合物，可用于细胞、细胞器、生物大分子、病毒等各种生物物质的分离或提纯【6】。该分离液的密度可以通过测定其折射率来确定，配置后可以进行高温高压的灭菌。可根据需要配置成不同密度的梯度离心液，主要用于脂蛋白的分离，也可用于淋巴细胞分离纯化。【7,8】
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供应商 品名 货号 规格
Axis-Shield Nycodenz（粉剂） AS1002424 1x500g
Axis-Shield LymphoprepTM 分离管（即用型） AS1019818 18Tubes x10ml
Axis-Shield OptiPrepTM 分离液（即用型）AS1114542 1x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分离液（即用型）AS1114544 1x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分离液（即用型）AS1114545 4x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分离液（即用型）AS1114547 1x500ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分离液（即用型）AS1114547 6x500ml
Axis-Shield NycoPrepTM 1.077 分离液（即用型）AS1114550 4x250ml
Axis-Shield NycoPrepTM 1.077 分离液（即用型）AS1114551 1x250ml
2、羟乙基淀粉（HES）离心沉淀法
HES是一种由高分子量支链淀粉经降解、羟乙基化并进一步加工处理后制成的血浆代用品【9】。自然状态下，HES与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞彼此以凹面相贴聚集而下沉，与血浆及单个核细胞形成清晰的界面。如果HES与外周血混合物经低速离心可加快红细胞的下沉，便于吸取含单核细胞层，使PBMC的分离过程简单化。该方法分离PBMC操作简便，成本低廉，分离细胞数量与密度梯度离心方法相当。然而该方法分离的细胞质量有待进一步提高。【10-12】
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国内多家血浆代用品供应商如湖北武汉康宝泰精细化工有限公司可以获得。
3、基于免疫技术的淋巴细胞分离法
目前多家生物制品公司均开发出的基于抗原抗体特异性结合的淋巴细胞分离试剂盒，主要有免疫磁珠分离法、流式细胞分选法【13,14】。这些试剂盒能特异性分离外周血或其它组织中的单一淋巴细胞类型，操作简便，所得细胞纯度高，可直接用于下游分子生物学实验。然而该法基于抗体技术，因此成本高，还未成为目前的主流淋巴细胞分离方法。
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供应商 品名 货号
Stem cell EasySep™ Magnet全淋巴细胞富集试剂盒 19961HLA
Stem cell EasySep™ MagnetT细胞富集试剂盒 19951HLA
Stem cell EasySep™ MagnetB细胞富集试剂盒 19954HLA
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主要参考文献：
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2. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Bøyum A, Løvhaug D, Tresland L, Nordlie EM. Scand J Immunol. 1991 Dec;34(6):697-712.
3. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum A.
Scand J Immunol. 1976 Jun;Suppl 5:9-15.
4. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. de Almeida MC, Silva AC, Barral A, Barral Netto M. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3
5. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.
Pino PA, Cardona AE. J Vis Exp. 2011 Feb 2;(48). pii: 2348.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3.
6. Iodixanol梯度离心法分离脂蛋白. 党美林，林元喜. 《第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集》.2009年
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8.Xingui Tian, Xiaobo Su, Xiao Li. Protection against Enterovirus 71 with Neutralizing Epitope Incorporation within Adenovirus Type 3 Hexon. PLoS ONE. July 2012,Volume 7, Issue 7 , e41381.
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