BIOCHECK BC-1303操作方法

BIOCHECK Inc.是新抗体发现和免疫测定开发服务的综合提供商。利用我们专有的B细胞克隆技术，我们可以直接富集阳性B细胞，分离IgG基因并表达用于各种应用的重组抗体。我们还是免疫诊断领域的开发商和制造商，在将新的IVD产品推向市场方面拥有丰富的经验。除了ELISA之外，我们现在还包括使用Simoa™技术（单分子阵列）进行超灵敏检测的分析开发，这是一种检测低丰度生物标记物的强大工具。

PD-L1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT Catalog Number: BC-1303

pd-l1酶免疫测定试剂盒目录编号：bc-1303

 

酶免疫法定量测定人血清和血浆中Pd-L1的浓度

 

只作研究用途

 

不适用于诊断程序

 

介绍

 

程序性死亡受体-配体1(pd-l1，b7-h1，cd 274)是b7家族的一种生物标志物，在多种细胞上表达，并在多种促炎细胞因子(如int)作用下被上调。 ERFERFON GAMMA 1，2，3。pd-L1与耗尽的T细胞表达的辅助受体pd-1相互作用，通过减少T细胞受体介导的增殖，促进免疫抑制性肿瘤微环境的形成。 N和细胞因子产生4，5。pd-1/pd-l1相互作用在免疫编辑过程中起着免疫检查点的作用，宿主免疫系统在此过程中消除了高免疫原性肿瘤。 使较少的免疫原性肿瘤逃避2，6。包括黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和结直肠癌在内的多种实体肿瘤类型利用pd-1/pd-L。 1免疫编辑机制。目前的治疗主要集中在阻断PD-1/Pd-L1相互作用，通过抑制Pd-1来减少肿瘤的逃逸，而Pd-L1和1，2则是新的研究重点。

测定原理

 

pd-L1酶联免疫吸附试验基于固相酶联免疫吸附试验的原理.该检测系统利用一种*的单克隆抗体对，针对一种*的抗原性测定方法。 Pd-L1分子上的蚂蚁。用一种小鼠抗Pd-L1单克隆抗体进行固相固定化(在微滴度井上)。另一种与马血清结合的单克隆抗pd-l1抗体 盘过氧化物酶(HRP)存在于酶的共轭溶液中。测试样本被允许与这两种抗体顺序反应，导致pd-l1分子被夹在溶胶之间。 ID期和酶解抗体。在室温下进行两次单独的60分钟孵育后，用洗涤缓冲液冲洗水井，除去未结合的标记抗体。添加TMB试剂 ED在黑暗条件下孵育20分钟，形成蓝色。随着停止解决方案的添加，颜色开发停止，将颜色更改为黄色。 Pd-L1的浓度与样品的颜色强度成正比。在450 nm处分光度法测定吸光度。

 

提供的试剂和材料

 

1.抗体包被井(1板，96井)微滴度井，用小鼠单克隆抗pd-l1包被。

 

2.20 ng/ml Pd-L1标准品(0.5 mL/小瓶)20 ng/mL Pd-L1在含防腐剂的磷酸盐缓冲液-BSA溶液中

 

3.标准稀释剂和样品稀释剂(30 mL/瓶，1瓶)含有含防腐剂的磷酸盐缓冲液-bsa溶液。

 

4.酶结合试剂(12 mL/小瓶，1小瓶)含有与辣根过氧化物酶结合的小鼠单克隆抗pd-l1。

 

20倍洗涤剂磷酸盐缓冲液(50 mL/瓶，1瓶)

 

TMB试剂(11 mL/瓶，1瓶)含有一步TMB溶液。

 

7. 停液(11 mL/瓶，1瓶)含有稀释盐酸(1NHCl)

 

 

贮藏条件

 

1.将未打开的工具包保存在2-8°C，收到后，当它没有使用，直到到期显示在工具包标签上。有关过期日期，请参阅包标签。

 

2.将微滴度板放在一个装有干燥剂的密封袋中，以尽量减少对潮湿空气的暴露。

 

试剂准备

 

1.所有试剂在使用前应允许达到室温(18-25°C)。

 

2.对于每次测试运行，准备一个新的标准集。

 

3.稀释20 ng/mL标准品至5ng/mL。用标准/样品稀释剂制备5纳克/mL标准的两倍系列稀释剂：

 

a.5 ng/mL：0.15mL 20 ng/mL标准品/样品稀释剂0.45mL

 

b.2.5纳克/毫升：0.25毫升5纳克/毫升标准品/样品稀释剂

 

c.1.25纳克/毫升：0.25毫升2.5纳克/毫升标准品/样品稀释剂

 

d.0.625 ng/mL：1.25ng/mL标准品/样品稀释剂0.25mL

 

e.0.313 ng/mL：0.25mL 0.625 ng/mL标准品/样品稀释剂

 

f.0.156 ng/mL：0.25mL 0.313 ng/mL标准稀释剂

 

g.0.078 ng/mL：0.25mL 0.156 ng/mL标准稀释剂

 

H.0 ng/mL：0.25 mL标准稀释剂

 

5.病人样本在使用前需要稀释4倍。制备一系列小管(即1.5 mL微离心管)，将60L血清与180 L标准/样品稀释剂混合。

 

6. 工作洗涤缓冲器：从20倍库存中制备1倍洗涤缓冲液。加入50毫升的20倍洗涤缓冲液库存到950毫升的直接水。工作洗涤缓冲液在2~8°C温度下稳定运行30天.注：任何晶体 这可能是由于高盐浓度的存在，必须在室温下再溶解，然后再进行稀释。

检测程序

 

1.准备标准。见试剂准备。

 

2.稀释样品1：4稀释。见试剂准备。

 

3.确保所需数量的涂层井在保持架。

 

4.配发Pd-L1标准的100mL，并将样品稀释到适当的井中.

 

5.室温(18-25°C)孵育60 min.

 

6.将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把井打在吸水性纸或p上 锥度毛巾，以消除所有残余水滴。

 

7.将pd-L1工作酶结合剂的100mL分配到每口井中.

 

8.室温(18-25°C)孵育60 min.

 

9.将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把井打在吸水性纸或p上 锥度毛巾，以消除所有残余水滴。

 

10.在每口井中分配100mL TMB溶液。

 

11.室温(18-25°C)孵育20分钟.

 

12.通过在每口井中加入100mL的停止溶液来停止反应。

 

13.轻轻搅拌30秒。重要的是要确保所有的蓝色*变成黄色。

 

14. 在450 nm处读取吸光度，15分钟内使用微滴度良好的阅读器。

统计

 

1.计算每组参考标准、对照和样品的平均吸光度值(OD 450)。

 

2.通过绘制每个参考标准的平均吸光度(以纳克/毫升为单位)绘制在图表纸上，在垂直(Y)轴上绘制吸光度，并绘制标准曲线。 水平(X)轴的接触。

 

3.用每个样品的平均吸光度值，从标准曲线上测定相应的Pd-L1浓度(ng/mL)。取决于经验和/或Comput的可用性 可以采用其他的数据缩减方法。

 

4.得到的样品值应乘以稀释倍数为4，才能得到Pd-L1的结果纳克/毫升。

 

标准曲线实例

 

一个典型的标准运行结果，吸光度读数在450 nm处显示在Y轴上，而pd-L1浓度显示在X轴上。注：本标准曲线为图示目的。 仅用于计算未知数，不应用于计算未知数。每个实验室必须在每个实验中生成自己的数据和标准曲线。

 

工作特性

 

用2SD法测定的Pd-L1酶联免疫吸附试验的低检出浓度为0.02ng/ml，低检出浓度为0.02ng/ml。

 

精度a.在一次测定中，通过对三种不同样品的重复测定，确定了内测精密度.批内可变性如下所示：

 

b.在一系列单独校准的测试中，通过对三个不同样本的重复测量，确定了运行间精密度。批间变异显示b。 below在下面，到下面

 

• 回收率和线性研究。回收样品加入已知的Pd-L1水平，并一式两份进行测定。平均回收率为90%。

 

 

 

 

b. 对三个样品进行连续稀释，以确定线性度。平均回收率为110.3%。

 

 

参考

1.赫布斯特，罗伊S.，等人。肿瘤患者对抗PD-L1抗体MPDL3280A的反应预测相关。“自然”515.7528(2014年)：563。

 

2.帕特尔，桑迪普·普拉文和拉泽尔·库兹洛克。pd-L1的表达是肿瘤免疫治疗中的一个预测生物标志物。分子癌症治疗学14.4(2015)：847-856。

 

3.书名/作者责任者：by L.靶向PD-1/B7-H1(PD-L1)通路，激活抗肿瘤免疫。免疫学新意见24.2(2012年)：207-212。

 

4.布兰克克里斯汀和安德烈亚斯·马肯森。PD-L1/PD-1通路对T细胞衰竭的贡献：慢性感染和肿瘤逃避的新研究进展。癌症免疫学 治疗，疗法，疗效 56.

 

5(2007)：739-745。5.Barber，Daniel L.，等。慢性病毒感染时衰竭CD8 T细胞的功能恢复“自然”439.7077(2006年)：682。

 

6.Teng，Michele WL，等。根据T细胞浸润和pd-L1分类癌症。癌症研究75.11(2015)：2139-2145。

 

 

 

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BIOCHECK bc-1301操作方法

BIOCHECK Inc.是新抗体发现和免疫测定开发服务的综合提供商。

PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT   Catalog Number: BC-1301

 

pd-1酶免疫测定试剂盒   目录编号：bc-1301

 

酶免疫法定量测定人血清和血浆中Pd-1浓度

 

只作研究用途

 

不适用于诊断程序

 

介绍

程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一种细胞表面受体，是调节T细胞炎症活动和维持免疫外周耐受的关键。 系统(1)。pd-1可以与配体pd-l1和pd-l2t相互作用。pd-1具有胞外IGV结构域、跨膜结构域和胞内尾部两个磷酸化位点(shp-1和shp-2)。 o下调免疫系统，抑制T细胞活性(2)。抗原识别后，活化的T细胞在其表面表达pd-1，产生干扰素，诱导pd的表达。 -L1，从而促进细胞凋亡或细胞死亡。(3)当被肿瘤细胞劫持时，pd-1配体的异常表达抑制免疫调节的T细胞活化，导致疾病进展。 （表示方向）向 (4).

 

血清和血浆中Pd-1水平升高与类风湿关节炎和皮肤硬化有关(5，6)。Pd-1主要由肿瘤浸润的T细胞(7)表达.进一步区域 研究表明，使用针对pd-1免疫检查点的单克隆抗体有助于在理解和治疗黑色素瘤和其他vario等癌症方面取得突破性进展。 美国非小细胞肺癌(4)。

测定原理

 

pd-1酶联免疫吸附试验是以固相酶联免疫吸附试验为基础的.该检测系统使用了针对不同抗原决定的*的单克隆抗体对。 pd-1分子上的NT。用一种小鼠抗PD-1单克隆抗体进行固相固定(在微滴度井上).另一种与辣根碱结合的单克隆抗pd-1抗体 过氧化物酶(HRP)存在于酶的共轭溶液中。测试样本被允许与这两种抗体依次反应，导致pd-1分子被夹在固体ph之间。 ASE和酶解抗体。在室温下进行两次单独的60分钟孵育后，用洗涤缓冲液冲洗水井，除去未结合的标记抗体。添加了TMB试剂 D在黑暗条件下孵育20分钟，形成蓝色。随着停止解决方案的添加，颜色开发停止，将颜色更改为黄色。c Pd-1的浓度与样品的颜色强度成正比.在450 nm处分光度法测定吸光度。

 

提供的试剂和材料

 

抗体包被井(1板，96井)微滴度井，用小鼠单克隆抗pd-1包被。

 

含防腐剂的磷酸盐缓冲液-BSA溶液中50 ng/ml Pd-1标准品(0.5 mL/小瓶)

 

标准稀释剂和样品稀释剂(30 mL/瓶，1瓶)含有含防腐剂的磷酸盐缓冲液-bsa溶液。

 

酶结合试剂(12 mL/小瓶，1小瓶)含有与辣根过氧化物酶结合的小鼠单克隆抗pd-1。

 

20倍洗涤剂磷酸盐缓冲液(50 mL/瓶，1瓶)

 

TMB试剂(11 mL/瓶，1瓶)含有一步TMB溶液。

 

停液(11 mL/瓶，1瓶)含有稀释盐酸(1NHCl)

 

贮藏条件

 

将未打开的工具包保存在2-8°C，收到后，当它没有使用，直到到期显示在工具包标签上。有关过期日期，请参阅包标签。

 

将微滴度板放在一个装有干燥剂的密封袋中，以尽量减少对潮湿空气的暴露。

 试剂准备

 

1.所有试剂在使用前应允许达到室温(18-25°C)。

 

2.对于每次测试运行，准备一个新的标准集。

 

3.用标准/样品稀释剂稀释50~10 ng/mL。用标准/样品稀释剂制备10 ng/mL标准的双倍系列稀释剂：

 

a.10纳克/毫升：0.12毫升50纳克/毫升0.48毫升标准品/样品稀释剂

 

b.5纳克/毫升：0.25毫升10纳克/毫升标准品/样品稀释剂

 

c.2.5纳克/毫升：0.25毫升5纳克/毫升标准品/样品稀释剂

 

1.25ng/mL：0.25毫升2.5纳克/毫升标准品/样品稀释剂

 

e.0.625 ng/mL：1.25ng/mL标准品/样品稀释剂0.25mL

 

f.0.313 ng/mL：0.25mL/0.625 ng/mL标准品/样品稀释剂2

 

标准稀释剂0.156 ng/mL：0.313 ng/mL 0.25mL

 

i.0 ng/mL：0.25 mL标准稀释剂

 

5.病人样本在使用前需要稀释4倍。制备一系列小管(即1.5 mL微离心管)，将60L血清与180 L标准/样品稀释剂混合。

 

6.工作洗涤缓冲器：从20倍库存中制备1倍洗涤缓冲液。加入50毫升的20倍洗涤缓冲液库存到950毫升的直接水。工作洗涤缓冲液在2~8°C温度下稳定运行30天.注：任何晶体 这可能是由于高盐浓度的存在，必须在室温下再溶解，然后再进行稀释。

 

检测程序

 

准备标准。见试剂准备。

 

稀释样品1：4稀释。见试剂准备。

 

确保所需数量的涂层井在保持架。

 

配发Pd-1标准的100mL，并将样品稀释到适当的井中.

 

室温(18-25°C)孵育60 min.

 

将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把水井打到吸水纸或纸上 r毛巾去除所有残留水滴。

 

将Pd-1工作酶结合剂的100mL配伍到每口井中.

 

室温(18-25°C)孵育60 min.

 

将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把水井打到吸水纸或纸上 r毛巾去除所有残留水滴。

 

在每口井中分配100mL TMB溶液。

 

室温(18-25°C)孵育20分钟.

 

通过在每口井中加入100mL的停止溶液来停止反应。

 

轻轻搅拌30秒。重要的是要确保所有的蓝色*变成黄色。

 

14.在450 nm处读取吸光度，15分钟内使用微滴度良好的阅读器。

 

统计

 

计算每组参考标准、对照和样品的平均吸光度值(OD 450)。

 

通过绘制每个参考标准的平均吸光度(以纳克/毫升为单位)绘制在图表纸上，并在垂直(Y)轴和浓度上绘制一条标准曲线。 在水平(X)轴上。

 

用每个样品的平均吸光度值，从标准曲线上测定相应的Pd-1浓度(ng/mL)。视经验和/或计算机可用情况而定 可以使用其他的数据缩减方法。

 

样品的检出值应乘以稀释倍数为4，得到Pd-1的结果为ng/ml。

 

标准曲线实例

 

一个典型的标准运行结果，吸光度读数在450 nm处显示在Y轴上，而pd-1浓度显示在X轴上。注：这条标准曲线是为了说明 仅用于计算未知数，不应用于计算未知数。每个实验室必须在每个实验中生成自己的数据和标准曲线。

工作特性

 

敏感，感受性

 

用2SD法测定的Pd-1酶联免疫吸附试验的低检出浓度为0.15ng/ml。

 

度，准确（性）

 

1. 在一次测定中，通过对三种不同样品的重复测定，确定了内测精密度.批内可变性如下所示：

b.在一系列单独校准的测试中，通过对三个不同样本的重复测量，确定了运行间精密度。批间变异显示b。 below在下面，到下面

1.回收率和线性研究。回收样品加入已知的Pd-1水平，并一式两份进行测定。平均回收率为105.3%。

b. 对三个样品进行连续稀释，以确定线性度。平均回收率为99.6%。

 

参考

费夫，B.T.，&Pauken，K.E.(2011年)。PD-1通路在自身免疫和外周耐受中的作用。“纽约科学院年鉴”，1217(1)，45-59。

 

Riella，L.V.，Paterson，A.M.，Sharpe，A.H.，&Chandraker，A.(2012)。PD-1通路在免疫应答中的作用。美国移植杂志：美国社会杂志 移植和美国移植外科医生协会，12(10)，2575-2587。

 

Zak，Krzysztof&Kitel，Radosław&Przetocka，Sara&Golik，Przemysław&Guzik，Katarzyna&Musielak，Bogdan&D mling，Alexander&Dubin，Grzegorz&Holak，Tad。(2015年)。胡氏情结结构 人类编程死亡1，pd-1，及其配体PD-L1。结构。23.。10.1016/j.str.2015.09.010。

 

Zoran Gatalica，卡丽·斯奈德，托德·马尼，阿纳托尔·加扎尔普尔，丹尼尔·霍特曼，年青肖，佩吉·奥夫伯格，因加罗斯，加吉·巴苏，塞米尔·弗拉尼茨，亨利·林奇，丹尼尔·冯霍夫和奥米德·哈米 d.程序化细胞死亡1(PD-1)及其配体(PD-L1)在常见癌症中的作用及其与分子肿瘤类型的关系。癌症流行病学研究2014年12月1日(23)(12)2965-2970。

 

Greisen，S.，Rasmussen，T.，Stengaard-Pedersen，K.，Hetland，M.，H rselv-Petersen，K.，Hvid，M.，&Deleuran，B.(2013年)。可溶性程序性死亡1(spd-1)的增加与疾病活动有关。 早期类风湿关节炎的影像学进展。斯堪的纳维亚风湿病学杂志，43(2)，101-108。

 

Yanaba，K.，Hayashi，M.，Yoshihara，Y.，&Nakagawa，H.(2016)。系统性硬化症患者血清可溶性程序性死亡-1和程序性死亡配体-1水平与皮肤硬化程度的关系 。皮肤科杂志，43(8)，954-957。

 

7.Ahmadzadeh，M.，Johnson，L.A.，Heemskerk，B.，Wunderlich，J.R.，Dudley，M.E.，White，D.E.，&Rosenberg，S.A.(2009年)。肿瘤抗原特异性CD8 T细胞浸润肿瘤高表达水平 Pd-1的LS和功能受损。血液，114(8)，1537-1544。