胶体金在快速检测中的应用

胶体金在快速检测中的地位

优良的稳定性、灵敏度、度及制造过程中的可重复性，使得胶体金适合基于膜的检测技术。

快速膜检测需求广泛，可应用于诸多领域（见下表）。随着灵敏度和特异性的提升，大量的潜在应用可能是作为替代昂贵仪器检测方法的低成本选择。

快速检测的应用

这篇文章重点讲述此种检测方法中极为重要的组成部分—检测标记物的生产制造对整个检测系统的性能及可靠性的影响；尤其是强调了胶体金标记物在此检测功能中的优势。

什么是快速检测？

快速检测是一种廉价的、一次性的、 基于膜的检测方法，它能提供分析物存在于液体样品的视觉证据。这种检测可以以独立的试纸条，也可以以装在塑料盒中的形式进行。总的来说，做此项检测至少只 需200ul的液体标本，可在2至5分钟内完成。在临床检测中，样品可能有尿、血液、血清、唾液或其他体液。

在非临床检测中，样本可能是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液，它们同样可以直接应用膜试纸条检测。这种检测方法无需仪器操作，可应用于临床、实验室、室外或者家庭——通常为无操作经验人员使用。

快速检测法有两种形式——层析和渗滤。层析是zui普通的形式因为其制造及使用都比较简易，这两种形式所涉及的原理虽然相同，但我们这里将要讨论的是层析检测法。
一个快速检测的底层一般是硝酸纤维素膜，在它上面固定了检测蛋白，通常是抗体或抗原（图1）。

图1 侧向层析快速检测试纸条的结构图

连接着膜的是包含有干燥金标的金标垫（通常是玻璃 纤维）。对于目前大多数可做的检测项目，这种结合垫含有吸附了针对待检分析品的特异性抗体或抗原的金粒子。样品垫通常为纸质，附着着结合垫。当使用样品垫 时，液体样品通过毛 细扩散作用穿移过结合垫，再水化金交联物，使待分析样品与交联物相互作用。然后金交联物与待分析样品复合物转移至膜条带上再移向蛋白结合物，复合物在此处 被固定后以一条细细的红线的形式产生明显的信号。第二条线是控制线，由余下的金交联物形成于膜上，表明测试完成。

顾名思义，快速检测应在短时间内提供结果，准确的说是在几分钟内。这种检测法必须方便、、可靠、廉价、是一次 性的而且操作简易的。它们也必须容易和清楚的说明书，甚至是没有经验的使用者也能操作。从生产厂家的观点来看，这种快速检测将会带来巨大的附加值，且容易 向世界各地的使用者推广，而无论使用者其有无此项检测的经验（见文后附言）。

快速检测功能广泛。改变抗体或者对条带的化学配方作微小的变动，同样的设计应能用于多种检测。

为何使用金标记？

早期的快速检测使用有色胶乳形成可视信号，目前的某些检测仍使用此手段。 过去和现在，乳胶法一直是凝集反应主要的标记方法，这是因为它在结合成分的存在下易于凝集。对于快速检测而言，交联物的稳定性是避免假阳性的关键，而易于凝集可能就是其产生假阳性的主要问题。

因为具有更好的潜在稳定性，20世纪80年代末，金标记被引入膜快速检测中。在适当的生产条件下，任何被大小的金颗粒都可以被重现性制造出来。 不同的大小可用于不同的用途。其优良的稳定性、敏感性、性及可重复生产性等特点使得金适合于在快速检测中的应用。金本性属惰性元素，被适当加工可形成 完整的球形颗粒。当正确连接时，蛋白质能牢固地结合在金颗粒表面，无论是液态或固态都能保持长久的稳定性。而且，若是在制造过程中蛋白被固定，其与金 交联物的非特异性结合可被减至零。

标记抗体和抗原的不同标记物优缺点的比较如表1所示：

表1.快速检测中常用标记物的特征比较

胶体金的制造

当胶体金被大量生产时，为保证批间重复性及避免不稳定性，成熟的工艺方法是必须的。为获得zui终稳定敏感的产品，生产100升高质量的胶体金就需要极度的细心与仔细以获得zui终稳定及高灵敏度的产品。在生产过程中的每一步都需要使用电镜检查来进行质量控制。

图２　金离子还原形成金颗粒

在过去的20年里，生产商们引进了各种不同的方法来合成胶体金，目的就是为了获得直径一定且均一的单分散性的胶体。尽管所有的生产方法都是依赖于还 原HAuCl4来形成金原子，但其物理条件还是有相当大的差异，如反应物添加的次序、还原剂使用的多寡、以及zui终生产出的胶体的质量（大小、形状、变异系 数等）。

大体来说，所有的生产方法都是使用还原剂提供电子给溶液中带正电荷的金离子而产生金原子，如下所示：

氯金酸＋还原剂＝胶体金

HAuCl4 + e– = Au0

通常使用的还原剂包括柠檬酸钠、黄磷、硼氢化钠、硫氰酸钠。图２所示为不同离子水平还原过程。

在加入还原剂之前，溶液中所含为100%金离子。曲线的纵坐标代表在加入还原剂时金离子转变为金原子的进程。加入还原剂之后，溶液中金原子的含量立 即出现急剧的上升，直到其达到过饱和。紧接着在一个被称作核化的过程中发生凝集作用，在核化位点形成由11个金原子构成的中央的二十面体金核心。核化位点 的形成是为了减少溶液中金原子的过度饱和，其形成极其迅速。此过程一旦完成，溶液中剩余的金原子在递减的能量梯度下继续结合核化位点直到所有的原子从溶液 中移除。

zui初形成的核数目决定了zui终将有多少颗粒形成于溶液中，而这个数目又反过来取决于所加入的还原剂的量。还原剂越多产生的晶核越多从而产生的金颗粒也 越多。显而易见，在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点的数目越多，zui终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。因而微粒的大小可通过所加入的还原剂的 量来精细调控。如果生产条件经过优化，所有的核化位点都可以在瞬间同时发生，使得所形成的金颗粒大小都*一致（即单分散型）。要做到这一点是很困难的。 大多数的生产方法都无法使所有金离子于瞬间同时得到还原并形成核化位点，从而造成核化过程的不均一及多分散性胶体的产生，zui终导致产品的重复性低下、交联 物不稳定。

图3 被包绕双电子层的胶体金颗粒

每个胶体金粒周围都包绕着来源于溶液中残留阴离子的负电荷层的金颗粒悬液构成（见图3），这种被称作zeta电位的电子层使得金颗粒之间相互排斥并在悬浮液中任意分布。zeta电位可以通过改变周围溶液中离子的浓度而被压缩或扩张。

高质量的胶体金和定制加工完好的交联物方便用于商业用途，通过从信誉度较好的供应商购买这些成分而非试图自己加工大批量的金不仅可以节省生产厂家的时间还可以减少他们的制作风险。

好胶体金和不好的胶体金

胶体金及交联物的生产制造表面看似简易，若掉以轻心则可导致生产出劣质、性能差及重现性极差的产品进而影响其商业用途。将这样的产品应用于快速检测 中可能导致结果的低稳定性、低敏感性及低特异性。为防止这样的结果出现，应使用透射电子显微镜（TEM）来评价胶体金的超细微结构。这种检测能使生产者对 照标准比较胶体的直径，得到颗粒球状、颗粒不规则性和颗粒直径的变化。

图4 胶体金与劣质（不稳定）胶体金

如果还原过程中核化作用及形成速度没有得到很好控制，粒子的形成就会不均一。（见图４），所见的粒子可能具有不同的大小及形状（如椭圆形、三角形、 长方形、菱形等等）。这样的粒子在与蛋白的结合过程中将无法被均匀包被，也不能在溶液中均匀分布。zui终将影响产品的颜色、敏感性、特异性及稳定性。仅仅 5%形状不均一的粒子都会影响测试的结果，使其*不具重现性。与代表着制作精良的40nm的单分散性胶体粒子的樱桃红色相比，由“劣质金”所形成的信号 常可见到淡蓝色或紫色。虽然在检测系统中白色背景膜上较暗的颜色更容易辨别，但暗示着潜在的不稳定性，而这种不稳定性更容易造成错误的结果。更严重的是， 粒子形状及尺寸的不均一会导致蛋白包被的不均一，这样会导致交联物长时间的积聚与凝集，储存于溶液中的交联物可能于几天甚至几个小时内就出现这样的变化。

即使立即将交联物干燥于固相基质上也无法*克服这个问题，在干燥过程中，由于粒子形状而未稳定结合的表面蛋白很容易分离，造成假阳性及高背景。

快速检测操作过程中一个zui常见的问题就是金交联物不能以适当的速度及完整形式从玻璃纤维结合垫上释放，这个问题常常是因为未*包被的金颗粒直接暴 露在玻璃纤维材料上而不能释放。这必然意味着表面蛋白或者*地附着在纤维基质上或离开金颗粒自由飘浮。开始就具备包被均一的单分散性球形粒子再加上制备 完好的金交联物，可大大减少这种危险问题的发生。

尽管TEM检测是决定胶体质量的*正确方法，但鉴定胶体或交联物是否包含融合的、凝集的或者不均一粒子亦或含有不同大小粒子群体的快速方法就是目 测它的颜色。的40nm（诊断应用中zui常使用的粒子大小）的胶体应该显示樱桃红色。如果胶体或交联物出现紫色，很有可能说明其质量低劣且不稳定。

金颗粒大小的选择

图5：因优化信号选择金粒子的大小

检测信号是由金颗粒聚集于测试线或控制线而出现的信号。这些粒子必须足够大到能被看见，粒子的尺寸越大，这些粒子聚集后就越容易被看见。例如1nm 直径的粒子，无论其聚集数量多少几乎都是不可能被看见的，因为1nm的粒子没有更大粒子所具有的亮红色。只有直径达到20nm的粒子才会出现可见的信号。 随着粒子尺寸的增大，位阻现象又成了一个问题（见图5）。例如，如果IgG（160，000道尔顿）分子仅仅8nm长，大约4nm从金颗粒表面伸展开，那 么，100nm的粒子将会使这些小的表面分子显得更小而很难与特异性的蛋白相互作用。此外，这些粒子的尺寸越大，它们在既定体积溶液中存在的数量越小。

这种可见度的需要与位阻现象之间的矛盾现象表明，对于大多数的免疫检测应用而言，zui适的粒子大小是40nm.在某些情况下当位阻现象成为较大问题时 （如针对较小的抗原），20nm的粒子则更为合适；当希望出现更深颜色或当分子表面较低的曲率提高了抗原抗体分子间的交互作用，较大一点的粒子则更为可 取。应该由实验决定确定多少颗粒大小能带来高灵敏度、浅背景色和高稳定性。

胶体金的制造

制造者必须了解让他们的蛋白与胶体金持久结合的物理及化学进程，具备了这些知识之后，要进行从小批量制造到大规模生产就变得轻而易举，而无须以牺牲 产品的敏感性、稳定性、特异性或重现性为代价了。仅仅把交联物揉合到一起，虽然成本低廉且简易，却通常会导致聚集体的形成。通过TEM可以观察到，每一个 聚集体都是由4个或更多金交联物分子组成的群体。这种聚集体的存在通常预示着产品的不稳定性，其性能会随着时间而改变。虽然比较未聚集的产品刚开始具有更 高的灵敏度，但这些产品很快会出现稳定性和特异性的问题。

一种好的交联物表现为蛋白吸附于金的表面上，与胶乳不同的是，蛋白是被动地吸附于交联物表面，因而不会出现共价结合。然而，由于某些小分子与金表面 没有足够的结合位点；像激素、药物及其他小分子（<10KD）在被动交联之前必须先结合到大分子载体上，多为BSA.在任何情况下，位阻现象都会阻 碍小分子升至zeta电位。载体应该是惰性的，这样就不会影响检测蛋白质的活性。

抗体的Fc片段紧紧吸附在金颗粒表面上，这样围绕着金颗粒的双电子层表面的Fab片段就突出在外面，这样Fab就能吸附分析物（见图6）。胶体金上 标记抗体时，不能有过量的待标记抗体存在。因为过量的游离的抗体会跟胶体金上的抗体与抗原发生竞争反应，导致出现假阴性，而且过量的抗体蛋白会影响到标记 物的稳定性。蛋白质和胶体金结合的*条件在蛋白质的等电点附近。

蛋白通过以下机制于几秒之内吸附于金表面：

图6 抗体与金粒子的结合力

（1） 金粒子所带负电荷与蛋白内氨基酸（如赖氨酸）所带阳性电荷的zui初的相互吸引

（2）蛋白通过某些氨基酸残基包括色氨酸与金粒子表面之间的疏水吸附作用

（3）蛋白中的半胱氨酸的硫基与金粒子间的配价结合

交联物的稳定

随着特异蛋白的结合，交联物必须用适当的试剂进行稳定，通常使用BSA、明胶、PEG（聚乙二醇）或酪蛋白。使用稳定剂有双重功能，一是它可通过封闭胶体表面未和特异性蛋白结合的位点而减少了非特异性反应；二是它可有助于更稳定的悬液的形成。

一旦结合，金即被调整至预期的浓度，并混悬于相应的缓冲液中。这种缓冲液应可使液体交联物稳定，商业生产者常会使用低摩尔浓度缓冲液以使得工业客户 能简单重悬交联物于自己所选的缓冲液中。总的来说，zui终的储存缓冲液不应含有高盐缓冲液和表面活性剂，因为它们有可能通过水解或置换抗体造成损伤。含有硫 基或汞的防腐剂会造成交联物的*毁坏。胶体金zui常用的防腐剂为0.1%叠氮化合物。

专业制作出的胶体金的储藏几乎是无限期的。通过计算有多少结合剂可吸附到金粒子的表面，可能会减少批间差，其形成的交联物比单独的抗体可更长久的储存；恰当干燥于固相组分的金标蛋白则可保存数年之久。

胶体金的大规模制造

尽管已经有技术及科学的资料来描述出简单的小量胶体金和交联物的生产过程，但应用于大批量商业生产（譬如100升的量）时的方法仍旧存在着所有权的 问题。假设从氯金酸至胶体金的还原过程必须于微秒之内完成，那么100升或更大量产品的生产则需要非常精细的技术而不是仅仅遵循着小量产品生产的同一原 则。

由于这些技术仅仅为用于商业生产的金交联物企业中的专家所熟知，所以大多数生产者不会试图在企业内部选择这种艰巨的任务生产大批量的胶体金。相反，快速检测试剂的生产商会与胶体金专家合作，籍此来减少费用的成本和失败的危险，同时也可以使得他们的产品尽快走向市场。

这样的合作安排通常由生产商进行内部的实验开始，这些实验使用小量商业用途的胶体来决定何种抗体zui适于其应用。随后，一些企业内部进行更大量的胶体 交联实验来决定按比例放大10倍或100倍的产品是否能生产出相同质量的交联物。在提高温度和应用不同缓冲液以及干燥状态下进行此阶段的严格的金交联物稳 定性实验操作是尤其重要的。质量控制应包括使用TEM检查有关聚集产生的情况、光密度、敏感性及特异性。在进行大批量快速检测产品的生产之前，多批次地进 行这种大量的实验来决定生产的重现性是很有必要的。

定量的可能性

大多数的快速检测只是定性的，只能用于检测临床样本中是否含有超过检测浓度的特定生物成分存在。然而，有许多的检测则需要一种定量的元素，例如监控临床指标的变化或确定特定分析物的相对或浓度。

这样的检测包括三种形式，*种形式是，当进行测试时，许多内在的信号可出现测试结果在视觉上的对比，这种测试仅仅能提供半定量的结果，结果可分为 阴性、弱阳性、中阳性和强阳性。第二种类型，检测线的反应剂设计成只能结合已知一定量的分析物，任何过量的分析物将会和下一条检测线结合，产生一个温度计 式的条带梯度。

在第三种测试类型中，测试样品所产生的信号由一个小型的、便携式的分析仪读取，并由分析仪将有色的测试线转换为数字信号，许多这样一般的条带测试读取仪将于近期应用于商业用途。

金标记尤其适合于这种定量或半定量的测试，因为测试产生的信号既又具有高度可重复性。大多数的信号是利用光电二极管通过反射标定的刻度尺产生数 字，度取决于可被读取得测试结果的准确程度以及测试条带产生的可重现性信号的可靠程度。由于金标记的度，相对于许多其他类型的标记，其可产生的可 重现性信号具备更高的可靠性。

金标信号的银增强作用

无论以层析还是渗滤模的形式，快速检测法通常都可提供与ELISA 试剂盒相似或更高的敏感性。对大多数的待分析物而言，检测水平达到1ng/ml或更小的量是可能的。然而，也有许多待分析物对这种直接标记系统无法达到足够的敏感度。

要用肉眼在清晰背景的白色膜条上发现金产生的信号，其敏感度则要受到使用者能力的局限。使用光反射技术的定量方法常常无法达到人类肉眼视觉更大的敏 感性。使用银来增强金标记强度是一种有价值和前途的技术，它可获得增加100倍的检测敏感性。用这种方法将银溶液应用到测试线，来源于金标记的初期信号 （有时候是肉眼可见的）即可被增强。在应用较小粒子（约5nm）的金交联物的位置，使用这种间接方法可获得更大的总体敏感性。通过在一步测试法中掺入银试 剂就有可能无需任何其它步骤就使信号得到增强，这样液体样品的应用便能推进整个反应的进程（见图7）。所有的反应物（包括金交联物及增强剂银盐）都被干燥 于测试条带上仅由样品溶开。

图7层析快速检测中银对金标

这种间接的增强技术有望在pg/ml的范围内对待分析物进行检测。被干燥后的反应物是稳定的并有可能在聚集之前被引入测试装置中。由于敏感性的增 强，比目前用于直接标记的测试系统中更小量的样品也可被检测出。鉴于银的增强效果，使得为从前的交联检测法无法检测出的待分析物而研究开发出基于金的一步 检测法成为可能。

附言：

快速测试要求

基于膜上的快速检测法可广泛的应用于临床。虽然在临床环境中大多数检测是由专业的医疗保健人士操作，但越来越多的检测方法被批准由相对无经验的家庭 使用者操作使用。为创造可成功应用于这个特殊市场的快速检测法，生产商必须为这些有或无经验的使用者周全考虑。除此之外，生产商为了获得加工处理的效率而 控制成本必须有自己的一套需求。以下是目前快速检测产生的关键要求。

操作简易 或许操作上的简易是使得快速检测在商业上可行的zui重要特色。一般而言，这种检测都是应用多功能且简单的生化技术而无需或仅需极小的操作经验即可完成的。面向使用者、提高操作性简易性的特色包括一步操作法及测试结果易识别的特色。

样品量小 临床医生和家庭使用者都钟爱测试中仅需极少量样品这一点，此特色具有众多优点：收集样品时无需较多经验，通常操作速度较快，给患者造成的潜在伤害及疼痛也会较少，同时还能减少浪费。

快速 快速检测正因这一点而得名。在许多临床检测应用中会使用到快速检测，速度是其根本。根据临床医生需求，这种检测的理想目标就是在3分钟内提供结果，而许多快速检测都可满足这种要求。

灵活 对大多数的检测而言，若要满足临床医生需要即时出结果就可能要以牺牲检测结果的质量为代价。对生产商而言，应为快速检测选择那些可获得定性、半定量、或者定量结果而无需大幅置换基底物或反应物的理想的原材料。

临床应用 要使得快速检能在临床环境中得到广泛应用，它取得的结果必须可与临床实验室仪器检测所提供的相媲美。快速检测的理想特征包括高敏感性（<%的假阴 性）、高特异性（<%的假阳性）及长期稳定性（12个月以上），结合良好的检测设计，既有助于减少金交联物的应用时产生的假阳性和假阴性，又能增加 测试（交联物）的长期稳定性，商业用途的金交联物可达到长达１２个月的稳定性。

可靠性 快速检测的发展造就了大量多样化的测试片或试剂盒式检测模式的产生，适用的环境范围从紧急车辆到家庭环境不等。快速检测除了对物理条件不能苛刻外，更要求 其能提供变异系数在5%或更小范围内的可靠结果。若严格地控制生产条件，金交联物将有助于通过zui小化批量生产中的变异提升测试的可靠性。

低廉 欲用于临床检测的快速检测遭到同临床实验室检测一样全面降价的定价压力；欲用于家庭使用的快速检测又遭到同其他厂商相同产品的价格竞争；面对这两种情形，厂家必须面对每种测试结果都达到低成本的市场需求。

高附加值 为了能在以*的一次性快速检测中获利，生产商必须不断生产以降低产品成本。理想的测试应使用易获取的高质量的原材料，部件易于大量组装，这样才能达到原料及劳动力成本均低廉。要取得这种平衡，原料和试剂则适于使用比手工操作优势大得多的自动加工处理。

商业接受度 无论是由临床中受过训练的专业医疗人士还是毫无经验的家庭使用者使用，快速检测的设计必须关注消费者的可接受度。相比令操作者毫不费力操作的产品，令人棘手的储存及操作形式、难以识别的颜色都是产品难在商业上取得成功的弊端。

结语

当乳胶普遍用于结合物时，快速检测从20世纪80年代中期开始没有太大的变化。但自那以后，由于在大量快速检测法设计中对更高敏感性、可靠性及重现性要求的增加使得金作为交联物的。

制作精良的金试剂无论以液体还是干燥形式存在都具有极大的稳定性。如果继续有对基于金的快速检测有更大敏感性和特异性的需求，唯有对胶体金的生产和使用进行严格的操作才有可能取得成功。

参考文献

1、 J Chandler, Assay device and method, 96901447.1. European patent application, British Biocell International.

2、John Chandler, PhD, is the managing director, and Tracey Gurmin and Nicola Robinson are part of the custom consultancy team at BBInternational （Cardiff, Wales, UK）

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细胞转染技术原理及应用

细胞转染技术原理及应用

摘要： 讲述细胞转染技术分类,并分别介绍各种转染方法的原理、应用、特点,及各种转染方法的比较.       常规 转染 技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染.前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于 启动子 和其它调控元件的分析.一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果,常常用到一些报告系统如 荧光蛋白 ,β半乳糖苷酶等来帮助检测.后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体（episome）存在.尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高.外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因）,潮霉素B磷酸转移酶（HPH）,胸苷激酶（TK）等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系.

转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等.一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法, 脂质 体法各有利弊,其主要原理及应用特点如下：

转染方法    原理   应用   特点

磷酸钙法

磷酸钙DNA复合物吸附 细胞膜 被细胞内吞 稳定转染

瞬时性转染 不适用于原代细胞

操作简便但重复性差

有些细胞不适用

DEAE-右旋糖苷法

带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时性转染 相对简便、结果可重复  但对细胞有一定的毒副作用   转染时需除血清

电穿孔法

高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入 稳定转染  瞬时性转染

所有细胞 适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件

病毒 介导法

通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等

逆转录病毒

特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期   需考虑安全因素

腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染  特定宿主细胞 可用于难转染的细胞

需考虑安全因素

阳离子 脂质体 法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染

所有细胞 适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清.转染效果随细胞类型变化大

Biolistic颗粒传递法

将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达 瞬时性转染 可用于：人的表皮细胞,纤维原细胞, 淋巴细胞 系以及原代细胞

显微注射法

用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳定转染  瞬时性转染 转染细胞数有限

多用于工程改造或 转基因 动物的胚胎细胞

各种转染方法的比较：

除上述传统方法外,近年来上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对 细胞毒性 小,转染效率高受到研究者们的青睐.其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）的转染性能Z佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂.聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体.这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低.大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体.目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分.

线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些.但近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大.超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性低,但转染效率却较高.

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性,因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的 纳米颗粒 ,从而提高转染效率,当所形成复合物进入细胞以后,其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解,使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性,其可降解性对体内应用也具有重要的意义.

线性PEI——一种高效的阳离子聚合物转染试剂

转染效率更高，细胞毒性更低。线性PEI广泛适用于常见细胞系，如：HEK-293、HEK293T、Hep G2、Hela、CHO-K1、COS-1、COS-7、HIH/3T3和sf9等，PEI即使在有血清存在的情况下仍然能够高效的将核酸导入细胞，其具有优越的转染效率，重组蛋白的高表达水平，且与含血清的培养基相兼容，低细胞毒性，PEI的另外一个显著优势是较其他转染试剂使用成本极低。

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