Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光
| 货号 |
15262 |
存储条件 |
f/l |
| 规格 |
400 Tests |
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| Ex (nm) |
571 |
Em (nm) |
585 |
| 分子量 |
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溶剂 |
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| 产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和NADP +是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。
这种Amplite 荧光NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADPH。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了来自生物样品的干扰。
Amplite 荧光NADPH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，在100μL检测体积（1μM;图1）中检测少至100皮摩尔的NADPH。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。 该测定试剂盒已用于筛选使用NADP / NADPH作为辅因子的酶活性。 它还被用于在基于细胞的测定中灵敏检测NADPH。 与其他商业试剂盒相比，该试验具有更高的信号/背景比。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NADPH检测试剂盒。
产品说明书
96孔板测定示例
概述
准备NADPH反应混合物（50μL）
加入NADPH标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育15分钟 – 2小时在Ex / Em = 540/590 nm处
监测荧光增加
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作方法
1.准备NADPH原液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。
注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.准备NADPH反应混合物：
将10mL Amplite™NADPH测定缓冲液（组分B）加入NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
注意：这种NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：
3.1将50μLNADPH储备液（来自步骤1）加入450μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，得到100μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。
注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL100μMNADPH标准溶液，进行1：3连续稀释，得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH标准品系列稀释液。
3.3如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入到实心黑色96孔微量培养板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。
表1实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
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BL
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BL
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TS
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TS
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NS1
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NS1
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….
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….
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NS2
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NS2
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NS3
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NS3
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NS4
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NS4
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NS5
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NS5
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NS6
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NS6
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NS7
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NS7
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注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品
表2每个孔的试剂组成
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NADPH Standard
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Blank Control
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Test Sample
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Serial Dilutions*: 50 μL
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PBS: 50 μL
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50 μL
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*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份
4.在上清液反应中运行NADPH测定：
4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（（Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。
注意1：平板的内容物也可以转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
注意2：对于基于细胞的NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（cat＃20012）裂解细胞。
数据分析
空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。
注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。
图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 低至1μM（100pmol /孔）可以在孵育1小时（n = 3）时检测到NADPH，而NADP没有响应。
