Cell Meter APC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒 适合于流式细胞仪

简要概述

        Cell Meter APC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于细胞凋亡的试剂盒，膜联蛋白V可以与包括APC的荧光染料缀合。这种形式保留了其对磷脂酰丝氨酸（PS）的高亲和力，因此可用作流式细胞仪分析正在经历细胞凋亡的细胞的敏感探针。由于PS的外化发生在细胞凋亡的早期阶段，APC膜联蛋白V染色可以在比基于核变化（例如DNA片段化）的测定更早的阶段鉴定细胞凋亡。 APC膜联蛋白V染色先于膜完整性的丧失，这伴随着由细胞凋亡或坏死过程引起的新细胞死亡阶段。因此，APC膜联蛋白V染色通常与重要染料如碘化丙啶（PI）或7-AAD联合使用，以使研究人员能够识别早期凋亡细胞（7-AAD阴性，APC）膜联蛋白V阳性）。具有完整膜的活细胞排除7-AAD，而死亡和受损细胞的膜对7-AAD是可渗透的。例如，被认为存活的细胞是APC膜联蛋白V和7-AAD阴性，而早期细胞凋亡的细胞是APC膜联蛋白V阳性和7-AAD阴性，而晚期凋亡或已经死亡的细胞都是APC膜联蛋白V和7-AAD阳性。该测定不区分经历凋亡性死亡的细胞与由于坏死途径而死亡的细胞，因为在任一情况下，死细胞将用APC膜联蛋白V和7-AAD染色。然而，当随时间测量细胞凋亡时，通常可以从APC膜联蛋白V和7-AAD阴性（存活或无可测量的细胞凋亡）追踪细胞，APC膜联蛋白V阳性和7-AAD阴性（早期细胞凋亡，膜完整性存在） ） 后到APC膜联蛋白V和7-AAD阳性（末期凋亡和死亡）。细胞通过这三个阶段的运动表明细胞凋亡。相比之下，单个观察结果表明细胞本身是APC膜联蛋白V和7-AAD阳性，它们揭示了关于细胞经历其死亡的过程的较少信息。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter  APC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒。 

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产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.用测试化合物（200μL/样品）制备细胞
2.加入APC-膜联蛋白V测定溶液
3.在室温下孵育20-60分钟
4.使用FL4通道的流式细胞仪分析细胞（Ex / Em = 635/660 nm）

储备溶液配制

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. APC-Annexin V原液（100X）：
将含有0.2％BSA的200μLPBS加入到APC-膜联蛋白V缀合物（组分A）的小瓶中并充分混合以制备100X APC-膜联蛋白V储备溶液。 注意：将重构的100X APC-Annexin V储备溶液储存在4 ℃。有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

操作步骤

1.用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。注意：膜粘附细胞的膜联蛋白V流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。

2.离心细胞，得到1-5×10⁵个细胞/管。

3.将细胞重悬于200μL测定缓冲液（组分B）中。

4.向细胞中加入2μL100XAPC-膜联蛋白V原液。

5.可选：将2μL100X碘化丙啶（组分C）加入细胞中，用于坏死细胞。

6.在室温下孵育20至60分钟，避光。

7.可选：在使用流式细胞仪分析细胞之前，添加200至300μL的测定缓冲液（组分B）以增加体积。

8.使用具有FL4通道的流式细胞仪（Ex / Em = 635 / 660nm）监测APC-膜联蛋白V的荧光强度。当碘化丙啶加入细胞时，使用FL2通道测量细胞活力。

数据分析

        在活的非凋亡细胞中，APC-膜联蛋白V检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，APC-膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外叶上，因此导致染色强度增加。