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Screen Quest 比色法葡萄糖摄取检测试剂盒
简要概述
Screen Quest 比色法葡萄糖摄取检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于葡萄糖检测的试剂盒，葡萄糖转运系统负责将葡萄糖转运穿过细胞膜。测量组织和细胞中2-葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）的摄取被广泛接受作为估计葡萄糖摄取量和研究葡萄糖代谢的调节和胰岛素抗性机制的可靠方法。 2-DG摄取通常通过使用用氚或C14标记的非代谢的2-DG来确定。然而，常规使用放射性标记的探针是昂贵的并且需要繁琐的特殊处理程序。 AAT Bioquest的Screen Quest™比色葡萄糖摄取分析试剂盒可在组织或培养细胞中提供灵敏的非放射性分析。在该测定中，2-DG被葡萄糖转运蛋白吸收，并代谢成（2-DG6P）。不可代谢的2-DG6P在细胞中积累，并且与细胞的葡萄糖摄取成比例。累积的2-DG6P被酶促氧化并产生NADPH，其通过显色NADPH特异性监测。通过读取波长570nm至610nm的OD比，可以通过吸收酶标仪读取信号。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 比色法葡萄糖摄取检测试剂盒。
产品说明书
样品实验方案
简要概述
平板细胞并根据需要处理细胞
加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分钟
洗涤细胞并裂解细胞
加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
在室温下孵育30至120分钟
监测OD比率增加至570/610 nm
溶液制备
1.储备溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
KRPH缓冲液原液（1X）：
将20mL KRPH缓冲液（5X）（组分H）加入到80mL去离子水中并充分混合。 注意：对于大约一个96孔板，50 mL体积的1×KRPH缓冲液就足够了。 按比例准备所需的音量。 将未使用的1×KRPH存放在4ºC或-20ºC。
2.工作溶液配制
2.1 NADP工作溶液：
将100μLH2O加入到NADP（组分G）的小瓶中并充分混合。
2.2酶探针工作溶液：
将5mL测定缓冲液（组分F）加入酶探针瓶（组分E）中并充分混合。
2.3 2-DG摄取分析工作溶液：
将100μL的NADP工作溶液加入酶探针工作溶液中并充分混合。 注意：这些数量适用于一个96孔板。
有关细胞样品制备的指南，请点击查看。
操作步骤
重要提示：该方案可用作培养3T3-L1脂肪细胞用于2-DG摄取的指导。
1.在生长培养基中以50,000-80,000细胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000细胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底细胞培养Poly-D赖氨酸平板培养4-6小时。
2.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）无血清培养基除去细胞。将细胞在37ºC，5％CO2培养箱中孵育6小时至过夜。
3.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μL/孔1×KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞两次。
4.加入90μL/孔葡萄糖摄取缓冲液（组分B）并在37℃，5％CO2培养箱中孵育细胞1小时。
5.用或不用胰岛素或试验化合物刺激20分钟。加入10μL/孔的10×胰岛素溶液至终浓度为1μM或10×化合物测试溶液。并且还向未处理的孔中加入10μL胰岛素载体缓冲液或复合载体缓冲液作为对照，并在37℃，5％CO2培养箱中孵育20分钟。
6.对于葡萄糖摄取抑制研究，加入10×Phloretin至终浓度为200 uM或测试抑制剂，并在37ºC，5％CO2下孵育2-5分钟。注意：建议将10mL抑制剂载体缓冲液加入胰岛素处理和未处理的孔中作为对照。 Phloretin处理的细胞可用作阳性对照。
7.向每个孔中加入10μL/孔2-DG溶液（组分A），并在37℃，5％CO2培养箱中孵育20-40分钟。对于阴性对照，留下一些未经胰岛素，抑制剂和2-DG处理的孔。
8.处理后，取出每孔中的溶液，用KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞3次，100μL/孔，从溶液中除去额外的2-DG。从孔中移除KRPH缓冲液。
9.向每个孔中加入25μL/孔酸性裂解缓冲液（组分C），并在37℃下孵育20分钟以裂解细胞。并且可以同时制备2DG摄取测定混合物。
10向每个孔中加入25μL/孔中和缓冲液（组分D），充分混合，在室温下放置5-10分钟以中和细胞裂解物。
11.向2DG6P标准品或细胞裂解液的每个孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。
12.在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。
13.使用吸光度板读数器监测570 / 610nm处的吸光度比增加。
数据分析
| 图1.分化的3T3-L1脂肪细胞和3T3-L1成纤维细胞中2DG摄取的测量。 使用SpectraMax（Molecular Devices）酶标仪在黑墙/透明底细胞培养物Poly-D赖氨酸平板中用Screen Quest TM比色葡萄糖摄取测定试剂盒进行测定。 （A：阴性对照，无胰岛素无2-DG处理.B：不存在胰岛素时的2DG摄取.C：在1mM胰岛素存在下的2DG摄取.D：在1mM胰岛素和200mM根皮素存在下的2DG摄取。 E：在胰岛素1mM和5mM D-葡萄糖存在下2DG摄取。） |