Cell Meter 活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸PS检测试剂盒

简要概述

我们的Cell Meter 检测试剂盒是一套用于检测细胞功能的工具。在凋亡过程中，关键事件之一是胱天蛋白酶的激活。 caspase 3/7的激活对于凋亡的启动很重要。已经证明胱天蛋白酶3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物选择性。该试剂盒使用SR-DEVD-FMK作为荧光指示剂来检测caspase 3/7活性。 SR-DEVD-FMK具有细胞渗透性和无毒性，一旦与胱天蛋白酶结合，荧光试剂就会保留在细胞内。结合后阻止了胱天蛋白酶的进一步催化，但不会阻止凋亡的进行。 SR-DEVD-FMK是红色荧光标记试剂。膜联蛋白是在钙存在下与磷脂膜结合的蛋白质家族。 Annexin V用于检测在细胞表面表达磷脂酰丝氨酸（PS）的凋亡细胞。 PS在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的普遍指标。 Annexin V-dye缀合物通过测量PS的转运来检测细胞凋亡。该试剂盒中使用的Annexin V-iFluor 488 是绿色标记试剂，Ex / Em = 490/525 nm。该试剂盒旨在通过同时检测哺乳动物细胞中的Caspase 3/7和Annexin V活性来检测凋亡。该试剂盒还提供了一种Hoechst染料，用于标记整个细胞群体的细胞核；以及碘化丙啶染料，用于对坏死细胞进行染色。该试剂盒适用于荧光显微镜，流式细胞仪和荧光酶标仪。该试剂盒为所有必需成分提供了优化的测定方案。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸PS检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 用2×10⁶细胞/ mL的密度制备含测试化合物的细胞

2. 以1：150的比例添加TF3-DEVD-FMK和/或Annexin V-iFluor 488，以1：100的比例添加到细胞溶液中

3. 将细胞在37°C，5％CO₂培养箱中孵育1小时。

4. 沉淀细胞，用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞

5. 使用带有FITC和TRITC滤光片的荧光显微镜或带有FL1的流式细胞仪和膜联蛋白V-iFluor 488 和TF3-DEVD-FMK的FL2通道，检测Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）或550/595 nm（截止= 570 nm）的荧光强度（底部读取模式）。

溶液配制

储备溶液配制

1. TF3-DEVD-FMK储备溶液（150X）：将200 µL DMSO加入小瓶TF3-DEVD-FMK（组分A）中，制成150X TF3-DEVD-FMK储备液。

实验步骤

1.根据您的特定诱导方案，将细胞培养至 适合凋亡诱导的密度，但在96孔板上不超过2 x 10⁶细胞/ mL（或不超过3 x 10⁵细胞/ 100 µL /孔） ）。 同时，在每种标记条件下，用诱导群体相同的密度培养非诱导阴性对照细胞群体。 以下是在悬浮培养中诱导细胞凋亡的一些例子：
a.用2 µg / ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。
b.用1 µM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。
c.用4 µg / ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。
d.用1 µM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。 注意：应单独评估每种细胞系，以确定诱导凋亡的细胞密度。

2.以1：150的比例添加150X TF3-DEVD-FMK储备溶液和或以1：100的比例将Annexin V-iFluor 488 （组分B）添加到每个孔中。

3.将细胞在37°C，5％CO₂培养箱中孵育1小时。 注意：对于TF3-DEVD-FMK标记，细胞可以浓缩至约5 X 10⁶细胞/ mL。 对于贴壁细胞，用0.5 mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在与TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤一次。 合适的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。 贴壁细胞的膜联蛋白V流式细胞仪分析未经过常规测试，因为在细胞分离或收获过程中可能会发生特定的膜损伤。

4.如果需要，用DNA染色剂标记细胞（例如，对于整个细胞核染色剂，使用Hoechst标记，或者如果仅用Annexin V-iFluor 488 标记细胞，则用碘化丙啶标记死细胞）。

5.以约200g的转速旋转细胞2分钟，并用1 mL（或使用96孔板的孔，每孔200 µL）洗涤细胞（组分E）洗涤两次。 用所需量的洗涤缓冲液重悬细胞。 注意：TF3-DEVD-FMK和Annexin V-iFluor 488 是荧光的，因此重要的是洗净任何未结合的试剂以消除背景。 对于分离的细胞，应将细胞浓度调整为每个酶标仪孔，2-5 X 10⁵细胞/ 100 µL等分试样。

6.通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪检测荧光强度，对于TF3-DEVD-FMK，Ex / Em = 550/595 nm；对于Annexin V-iFluor 488 ，490/525；对于Hoechst染色，350/461 nm；碘化丙锭为535/635。
对于流式细胞仪：使用膜联蛋白V-iFluor 488 的FL1通道，用于TF3-DEVD-FMK的FL2通道来检测荧光强度。

对于荧光显微镜：将100 µL细胞悬液放入黑色96孔板的每个孔中。 在荧光显微镜下观察细胞，使用TRITC通道用于TF3-DEVD-FMK，FITC通道用于Annexin V-iFluor 488 （TRITC通道用于碘化丙啶染色，DAPI通道用于Hoechst染色）。

对于荧光酶标仪：将100 µL细胞悬液放入黑色96孔板的每个孔中。 使用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）或550/595 nm（截止= 570 nn）的Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）处检测荧光强度（底部读取模式）适用于TF3-DEVD-FMK。注意：如果需要平衡细胞浓度，请调整诱导细胞的悬浮液体积，使其接近非诱导细胞的细胞密度。如果细胞治疗不会导致受刺激的细胞数量急剧减少，则此调整步骤是可选的。