mFluor™紫色610 SE

简要概述

光谱流式细胞仪的进步已经 了常规流式细胞仪的应用范围和功能。现在，借助光谱流式细胞仪分析，研究人员和科学家们可以研究越来越多的目标分子。然而，荧光标记和读数的可用性严重限制了光谱流式细胞术的潜力。AAT Bioquest的mFluor™染料专为针对多色流式细胞仪的应用而开发，尤其是用于光谱荧光流式细胞仪。这些染料具有较大的斯托克斯位移，并且可以被流式细胞仪的激发光线（例如350 nm，405 nm，488 nm和633 nm）很好地激发。mFluor™紫色610染料被紫色激发光很好地激发，发出红色光〜610 nm。这些光谱特性使其成为光谱荧光流式细胞仪应用中非常独特的标记染料。mFluor™Violet 610 SE相当稳定，并且对蛋白质氨基具有良好的反应性和选择性。mFluor™Violet 610 SE提供了一种方便的工具，可通过紫色激发光激发标记流式细胞仪应用中的单隆，多隆抗体或其他蛋白质（> 10 kDa）。

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产品说明书

样品分析方案 

储备溶液配制

1.蛋白质储备液（溶液A）
将100 µL反应缓冲液（例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度> 2 mg / mL）混合，得到1 mL蛋白质标记储备液。
注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。
注意：蛋白质应溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须使用pH 7.2-7.4的1X PBS进行透析，以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，结合效率会大大降低。为了获得标记效率，建议 终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
 
2.染料原液（溶液B）
将无水DMSO加入mFluor™紫色610 SE小瓶中，制成10-20 mM储备液。通过轻柔移液或涡旋混合均匀。
注意：开始缀合之前，请准备染料储备溶液（溶液B）立即使用。染料储备溶液的长时间储存可能会降低染料活性，避免冻融循环。
注意：收到后，iFluor™染料应储存在<-15°C的环境中，并远离光线和湿气。
注意：重新配制的mFluor™紫色610 SE的DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存长达4周。
注意：所需的蛋白质缀合物应在载体蛋白质（例如0.1％牛血清白蛋白）存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度保存。

操作步骤

该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与mFluor™紫色610 SE的缀合物而开发的，供参考。您的实际情况可能需要进一步优化您的特定蛋白质。

确定染料/蛋白质比率（可选）
每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比率，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会不利地影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您使用一系列不同量的标记染料溶液，通过实验确定染料/蛋白质比率。通常，大多数染料-蛋白质缀合物推荐使用4-6种染料/蛋白质。

1. 以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5 µL染料储备溶液（溶液B，假定染料储备溶液为10 mM）添加到蛋白质瓶中。溶液（95 µL溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL，蛋白质的分子量为〜200KD，则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
   注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10％。

2. 进行缀合反应。

3. 重复步骤2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1；15：1和20：1。

4. 使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

5. 计算上述4种缀合物的染料/蛋白质比率（DOS）。

6. 对以上4种缀合物进行检测，以确定染料/蛋白质比率，以扩大标记反应的范围。 

进行缀合反应

1. 在有效摇动下，将适量的染料储备溶液（溶液B）添加到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。
   注意：溶液B /溶液的摩尔比由上述步骤确定。如果跳过该步骤（本节：确定染料/蛋白质比），我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1。

2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30- 0分钟。 

纯化
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。

1. 准备Sephadex G-25色谱柱。

2. 将反应混合物（步骤的最后一步：进行缀合反应后的混合物）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。

3. 样品刚好在顶部表面下方流动时，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

4. 向所需样品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4），以完成柱纯化。
   注意：为了立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
   注意：为了长期保存，染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥（见下文）。 

图示

图1.用mFluor™Violet 610抗人类CD4（隆SK3，小鼠IgG1，κ）结合物对人外周血淋巴细胞进行染色。