Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 蓝色荧光 405nm激发

简要概述

        Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于细胞凋亡的试剂盒，Cell Meter检测试剂盒是一类用于检测细胞功能的系列工具，包括细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜电位以及细胞周期等方面的指标。每种检测方案均能提供不同荧光颜色的检测方案。这些 的检测方案为从多角度研究细胞功能活动提供了一种十分有效的方法。Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒 *蓝色荧光 405nm处激发* 通过对磷脂酰丝氨酸(PS)进行检测，而实现细胞凋亡的检测。在凋亡细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）从胞内移位到胞外表面，因此PS出现在细胞的外表面可以作为细胞凋亡的起始或者中间阶段的通用指示器，也可以通过其形态学改变来测定。该试剂盒采用独有的蓝色荧光染料（Pacific Blue的优越替代物，使用Pacific Blue通道检测）标记的Annexin V检测凋亡细胞，同时包含PI红色荧光染料用于对坏死细胞进行染色。目前商业化各种Annexin V凋亡检测试剂盒一般是将Annexin V进行传统的荧光团（FITC、Cy3）标记后作为荧光探针，通过检测细胞凋亡早期细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS），从而实现对细胞凋亡的检测。然而目前的检测受到荧光颜色、荧光强度和检测灵敏度等因素的限制。Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit系列产品分别采用了mFluor Violet和iFluor荧光染料，这种染料比传统的FITC、Cy3等具有更高的荧光强度、更低的荧光背景和更 的光稳定性，因此检测效果更灵敏稳定；而iFluor系列染料在保证上述优势的同时，均在405nm处激发，尤其适合用于多色分析。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter Annexin V凋亡检测试剂盒。 

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产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.用测试化合物（200μL/样品）制备细胞
2.添加Annexin V-mFluor Violet 450检测溶液
3.在室温下孵育30-60分钟
4.使用具有Ex / Em = 405 / 450nm滤光器组的流式细胞仪或具有Violet滤光器的荧光显微镜分析细胞

操作步骤

使用膜联蛋白V-mFluor Violet 450制备和孵育细胞：

1.用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

2.离心细胞，得到1-5×10⁵个细胞/管。

3.将细胞重悬于200μL测定缓冲液（组分B）中。

4.将2μL膜联蛋白V-mFluor Violet 450（组分A）加入细胞中。

5.可选：将2μL100X碘化丙啶（组分C）加入细胞中，用于坏死细胞。

6.在室温下孵育30至60分钟，避光。

7.在使用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，添加300μL分析缓冲液（组分B）以增加体积。

8.使用具有Ex / Em = 405 / 450nm滤光片组的流式细胞仪或具有Violet滤光片的荧光显微镜监测荧光强度。

使用流式细胞仪分析：

1.使用流式细胞仪在Ex / Em = 405 / 450nm处定量膜联蛋白V-mFluor Violet 450结合。 当碘化丙啶加入细胞时，使用FL2通道测量细胞活力。 注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。

使用荧光显微镜分析：

1.孵育后移取细胞悬液，用测定缓冲液冲洗1-2次，然后用测定缓冲液重悬细胞。

2.将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。 注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与V-mFluor Violet 450孵育后，用测定缓冲液冲洗1-2次，并将化验缓冲液加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并可视化细胞。 在与V-mFluor Violet 450一起温育后，细胞也可以固定在2％甲醛中，并在显微镜下观察。

3.使用Violet通道在荧光显微镜下用V-mFluor Violet 450分析凋亡细胞。 当碘化丙啶加入细胞时，使用TRITC通道测量细胞活力。 质膜上的蓝色染色表明V-mFluor Violet 450与细胞表面上的PS结合。

数据分析

        在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。