PhosphoWorks 荧光法磷酸盐检测试剂盒 *红色荧光*

简要概述

PhosphoWorks 荧光法磷酸盐检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测磷酸盐的试剂盒，细胞利用多种磷酸盐 (Pi) 和多聚磷酸酯作为酶底物、第二信使、膜结构成分和生命能量储存器。磷酸盐参与许多生物过程。例如，磷酸酶、ATP 酶和其他几种酶催化从磷酸酯底物释放无机磷酸盐的生化反应。许多磷酸酯代谢酶的检测很困难，因为没有合适的底物。通常有必要使用繁琐的比色测定或基于放射性同位素的方法来确定无机磷酸盐的释放。这款 PhosphoWorks™ 荧光磷酸盐检测试剂盒专为使用我们的红色荧光磷酸盐探针检测任何 Pi 生成酶的活性而开发。该试剂盒提供对 Pi 的灵敏检测，是危险放射性方法和其他不太敏感的比色测定的替代方法。 Pi 的测量基于我们新型磷酸盐探针的吸光度和荧光变化。我们的试剂盒提供所有必需的试剂，包括磷酸盐探针、磷酸盐标准品和检测缓冲液。该测定法可对溶液中浓度至少低至 0.1 µM 的磷酸盐进行定量。它可用于通过耦合两种酶促反应来测量磷酸酶（如 GTP 酶和 ATP 酶）释放磷酸盐的动力学。该测定可以使用96 孔或 384 孔进行检测，并且无需分离步骤即可轻松适应自动化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的PhosphoWorks 荧光法磷酸盐检测试剂盒。 

产品说明书

操作步骤

简要概述

准备测试样品或磷酸盐标准品（40μL）
加入等体积的分析缓冲液（40μL）
添加磷酸盐工作溶液（20μL）
在室温下孵育15至60分钟
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570 nm）

溶液制备

1.制备储备溶液

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1磷酸盐储备液（125X）：
在磷酸盐（组分B）中加入20μLDMSO，制成125X磷酸盐原液。

2.制备标准溶液

磷酸盐标准溶液
将50μL的1mM KH 2 PO 4（组分C）加入950μL去离子水或酶反应缓冲液中，得到50μM磷酸盐标准溶液（PS7）。 取50μM磷酸盐标准溶液（PS7）并进行1：2连续稀释，用去离子水或酶反应缓冲液得到连续稀释的磷酸盐标准品（PS6-PS1）。

3.制备工作溶液

将20μL125X磷酸盐储备溶液加入2.5 mL无菌H₂O中，充分混合，制成磷酸盐工作溶液。 避免潜在的Pi污染。 注意：避免磷酸盐（组分B）直接暴露在光线下。 由于该测定法对Pi的高灵敏度，使用无Pi实验室器皿和试剂极为重要。

样品实验方案

在pH 6.5至7.4下进行磷酸盐测定

表1.实心黑色96孔微孔板中磷酸盐标准品和测试样品的布局。

PS =磷酸盐标准品（PS1-PS7,0.78至50μM），BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。

1.根据表1和2中提供的布局制备磷酸盐标准品（PS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用20μL试剂代替40μL。

2.向磷酸盐标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入40μL测定缓冲液（组分A）和20μL磷酸盐工作溶液，使总磷酸盐测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入20μL测定缓冲液（组分A）和10μL磷酸盐工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.将反应混合物在室温下孵育15至60分钟。

4.用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算Pi样本。 我们建议使用在线线性回归计算器，该计算器可在以下位置找到：

图1.使用Novostar酶标仪（BMG Labtech），在实心黑色96孔板上用PhosphoWorks 荧光磷酸盐测定试剂盒测量磷酸盐剂量响应。

参考文献

Sacrificial crystal templating of hyaluronic acid-based hydrogels
Authors: Richelle C Thomas, Paul E Chung, Shan P Modi, John G Hardy, Christine E Schmidt
Journal: European Polymer Journal (2016)

Osteogenic cell cultures cannot utilize exogenous sources of synthetic polyphosphate for mineralization
Authors: Marianne B Ariganello, Sidney Omelon, Fabio Variola, Rima M Wazen, Pierre Moffatt, Antonio Nanci
Journal: Journal of cellular biochemistry (2014): 2089–2102

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