单克隆抗体的基本原理和过程
单克隆抗体的基本原理和过程
通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。应用此技术从一个抗体分泌性B细胞杂交瘤分裂增殖，形成一个大的细胞克隆。由B细胞杂交瘤细胞克隆产生的只识别抗原分子上某一个抗原决定簇的纯抗体，即单克隆抗体。单克隆抗体具有纯度高、特异性强、利于实验标准化即可大量生产供应等特点。
在单克隆抗体制备中，虽然除小鼠外其它动物也可用于制备杂交瘤，但本书以小鼠为例来说明有关技术，同样的技术也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗体筛选。对特殊动物之间或与人细胞的融合，也有简要说明。
单克隆抗体的制备是一个复杂、精细的工艺过程。为对全过程有一个概括的了解，先用表1 列出mAbs制备过程中的各个阶段。一般将全过程分为三个阶段：（1）免疫小鼠；（2）建立筛选方法和程序；及（3）杂交瘤生成。
表1 杂交瘤细胞生成的各个阶段和所需时间
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动物免
疫阶段
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初始免疫
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两周
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一个月到一年
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10天
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强化免疫
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血清测试
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方法建
立阶段
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筛选方法的建立与测试
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zui少
两周
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大约一个月
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zui后一次强化免疫
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三
天
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杂交瘤细胞生成阶段
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大约
一周
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细胞融合
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大约一个月
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筛选阳性克隆
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阳性克隆扩增及冻存
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大约
一周
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单细胞的克隆生长
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筛 选
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部分阳性细胞扩增*
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大部冻存（保留zui后所得的杂交瘤细胞）
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*得到扩增的阳性杂交瘤细胞后，可从其培养液中收集含单克隆抗体的上清液，进行鉴定（其抗体含量为10-50µg/ml）；
*杂交瘤细胞也可进行小鼠腹腔注射，以产生Mab含量高的腹水（其抗体含量为1-10mg/ml）。
以上每一阶段都有可能迅速顺利完成，但各阶段也都有其本身的问题，需在实验开始前予以充分考虑，以免影响全局。以下分别进行讨论。动物在注入抗原后，一旦出现良好的体液免疫应答，同时又已建立合用的筛选方法，并通过血清对所建立筛选方法进行评价、确定方法后，才可开始杂交瘤细胞的制备。其过程大致为：在细胞融合前数日，用抗原免疫动物；将从免疫动物得到的分泌抗体的细胞与骨髓瘤细胞相混，进行细胞融合（有效的细胞融合约可得1/105存活的杂交细胞）；其后，将融合细胞用所选择的培养基限定稀释，置多孔培养板进行培养。在细胞融合后一周，即可对杂交瘤进行测试，从阳性培养孔所取的细胞先增殖，然后，进行克隆化（即单克隆生长），杂交瘤的生成与克隆需要时间，很少的实例只需要两个月，有的甚至要一年时间。因制备mAbs 过程中的每一步都对其后各步影响很大，因此均需注意选择zui适宜的条件，如：
l 要注意抗原的选择及其性质，如细胞、蛋白质、半抗原等；
l 根据抗原得性质和得量和对抗体得要求等，计划及建立免疫的途径和方式；
l 选定筛选的方法：抗体筛选的测试方法必须简单、可重复、特异，并可适用于mAb的zui终使用（即免疫荧光、免疫沉淀、功能试验等中的应用）；
l 要确定细胞培养的条件；
l 进行细胞融合的方式：包括杂交方法和细胞的选择，和克隆的方式（限制性稀释或软胶法）等。
典型的单克隆抗体的制备过程为：
1． *次对每一小鼠注射500µl抗原与*福氏佐剂1：1的混和液（ip）。 共注6支BALB/c雌性小鼠（抗体的实际需用量见表2）；
2．14天后，再次注射，但改用抗原与不*福氏佐剂混合液；
3．第24天，从免疫小鼠尾静脉取血，血清经PBS 1：5稀释，以同样稀释的正常血清为对照，用点杂交（Dot blot）法进行测定；
4．第35天，所有小鼠均经腹腔再注射抗原与不*福氏佐剂混合液；
5．第45天，取尾静脉血，用点杂交法再次检测。所有血清样品均通过与在体同位素标记的抗原进行免疫沉淀法检测；
6．第56天，对免疫应答的小鼠再静脉注射100µl 及腹腔注视100µl不*福氏佐剂抗原混合液，而对所有其余小鼠仅腹腔注射不*福氏佐剂抗原混合液；
7．第59天由免疫应答的小鼠取脾细胞进行细胞融合；
8．第66天，开始艰巨的工作，寻找*个阳性克隆的筛选。
*具体免疫抗原用量参见表2。
表2 抗原的参考用量
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抗原类型
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举 例
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初次免疫及加强免疫
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zui后加强免疫
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抗原的剂量与方式
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抗原的剂量与方式
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可溶性蛋白
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酶、多肽与载体蛋白
复合物、免疫复合物
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5-50µg,+佐剂，ip或sc
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5-50µg, -佐剂，iv
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颗粒性蛋白
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已杀死的病毒或酵母
或细菌，结构蛋白
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5-50µg,+佐剂，ip或sc
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5-50µg, -佐剂，iv
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不溶性蛋白
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细菌包含体的产物
与固相小球结合的
经免疫纯化蛋白
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5-50µg,+佐剂，ip或sc
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5-50µg, -佐剂，ip
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活 细 胞
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哺乳动物细胞
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105-107 细胞—佐剂，ip
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106 细胞, -佐剂，iv
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活癌源细胞
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哺乳动物癌源细胞
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104-106 细胞—佐剂，ip
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106 细胞, -佐剂，iv
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糖 类
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多糖、糖蛋白
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5-50µg,+/-佐剂，ip或sc
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5-50µg, -佐剂，iv
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核 酸
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核酸与载体蛋白复合物
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5-50µg,+佐剂，ip
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5-50µg, -佐剂，iv
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ip 腹腔注射； sc 皮下注射；iv 静脉注射
人员要求和仪器设备
杂交瘤得制备需要优良的组织培养设备及训练有素、有经验的专门技术人员。
培养杂交瘤及有关细胞所需设备有：
l 有专门空气过滤装置的细胞培养场所
l 有关实验动物所需条件
l 免疫用注视器和针头
l 通风橱
l 湿度维持5-8%、37℃的CO2 孵箱
l 倒置显微镜（具有×10及 ×20物镜，× 10-15 目镜）
l 用于细胞记数的光学显微镜
l 红细胞记数器
l 37℃水浴
l 洗细胞用低温离心机
l 一次性塑料培养板（24孔和96孔）及培养瓶
l 15及50ml 消毒的聚丙烯锥形管
l 消毒1，2，5及10 ml 的吸管及吸液器
l 低温冰箱（–80℃）及液氮罐
参考文献
1．Galfre, G. And Milstein, C. （1981） Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedure. Methods in Enzymology. 73,3-46
2．瘤技术与单克隆抗体制备” 见巴德年主编 《当代免疫学技术与应用》pp.351-373 北京医科大学中国协和医科大学出版社 1998。
3．胞融合杂交及单克隆抗体技术” 见杨景山主编《医学细胞化学与细胞生物学技》pp.452-469北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1992 。