大多数用于分离肝细胞的传统方法使用粗制和部分纯化的酶制剂，包括各种类型的胶原酶和其他蛋白酶。最近，使用更好表征的胶原酶制剂，例如 Worthington Types 1 和 4 (CLS-1, 4)，已经提供了更好的结果。所有粗胶原酶制剂都可能包含批次不同的污染蛋白酶、酯酶和其他酶，需要研究人员预先筛选几批酶和/或不断修改分离参数和协议。

Worthington 肝细胞分离系统的开发旨在为研究人员提供可靠、方便且一致的肝细胞分离系统。通过使用该试剂盒中包含的预先优化的酶组合，可以最大限度地减少批次间的差异并提高分离肝细胞的质量。此外，Worthington 通过从成年大鼠中分离肝细胞来对每一批次进行使用测试，以确保活细胞的性能、可靠性和一致的产量。

该方法基于 Berry, MN 描述的方法，由 Seglen, PO 修改（细胞生物学方法，第 XIII 卷，David M. Prescott 编辑，学术出版社，1976 年；第 4 章，“分离大鼠肝细胞的制备”， pp 29-83），并与几位研究人员一起进一步优化。

稳定性/储存：试剂在环境温度下可在正常运输程序中预期的时间内保持稳定，但包装应在抵达时冷藏。内容物在使用前可在 2-8°C 下储存 4-6 个月。储存在 2-8°C。

包装内容 包装中包含足够的材料，可用于五个单独的成年大鼠肝脏灌注。对于较大或较小的组织应用，请在每个步骤中制备成比例的试剂，并按照协议中所述的相同比例将它们组合起来。

小瓶 #1：10X CMF-HBSS 浓缩液，1 瓶，500 毫升无菌不含钙和镁的汉克平衡盐溶液 (CMF-HBSS)。在加入解离酶溶液之前，该溶液用于洗涤和灌注肝脏。

小瓶 #2：22,500 单位胶原酶和 30 单位弹性蛋白酶，5 小瓶 Worthington 胶原酶（代码：CLS-1）和弹性蛋白酶（代码：ESL），通过 0.22µm 孔径膜过滤并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液重新配制，并按照以下程序的指示轻轻旋转以溶解内容物。将未复溶的小瓶储存在 2–8°C。

小瓶 #3：每瓶 1,000 单位 DNase I，5 小瓶 Worthington DNase I（代码：D），通过 0.22µm 孔径膜过滤并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液重新配制，并按照以下程序的指示轻轻旋转以溶解内容物。将未复溶的小瓶储存在 2–8°C。

小瓶 #4：0.15M MOPS，pH 7.5，1 瓶，75ml 0.15M MOPS，pH 7.5 缓冲液浓缩物，用于缓冲重组的 Leibovitz L-15 培养基。小瓶 #5：7.5% 碳酸氢钠 (NaHCO3)，1 瓶，100ml 7.5% 碳酸氢钠浓缩液，用于缓冲稀释的 CMF-HBSS。

小袋，装有 Leibovitz L-15 培养基粉末，1 x 1 升 通过切开信封顶部并将内容物倒入装有大约 800 毫升细胞培养级水的烧杯中，重构小袋中的全部内容物。再用 100 毫升水冲洗小袋 2 – 3 次。使总体积达到 1000 毫升并通过 0.22 微米孔径的膜过滤。

参考

Alpini 等，“肝细胞分离的最新进展”，Hepatology (1994) 20:494-514。

贝里，明尼苏达州，爱德华兹，上午和巴里特，GJ；分离的肝细胞：制备、特性和应用，RH Burdon 和 PH Van Knippenberg，编辑，爱思唯尔，阿姆斯特丹，纽约，牛津，第 1 章。2, 1991.

Chen HL、Wu Hl、Fon CC、Chen PJ、Lai、MY、Chen DS (1998) 成人肝细胞的长期培养。生物医学科学 5:435-440

DeRobertis, EDP, Saez, FA 和 DeRobertis, EMF: Cell Biology, 6th ed., WB Saunders Co., Philadelphia, PA, 1975。

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汉克斯、JH 和*，RE：Proc。社会。经验。生物。医学，71, 196 1949。

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Le Cluyse EL (2001) 用于体外评估细胞色素 P450 酶表达和调节的人类肝细胞系统。欧元。J Pharm Sci 13：343-368。

Le Cluyse EL, PL Bullock, A Parkinson (1996) 在大鼠肝细胞长期培养中恢复和维持正常肝脏结构和功能的策略。高级 Drug Del Rev 22：133-186。

Leibovitz, A.：与大气自由气体交换的组织/细胞培养物的生长和维持，Am。J. Hyg., 78, 173, 1963。

Seglen，PO，细胞生物学方法，卷。XIII，David M. Prescott 编辑，Ch。4，第 29-83 页，学术出版社，1976 年。

沃辛顿酶手册，沃辛顿生化公司，新泽西州弗里霍尔德，1993 年。

沃辛顿组织解离指南，沃辛顿生化公司，新泽西州莱克伍德，2003 年。 

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