点突变试剂盒1.0说明书

点突变试剂盒1.0说明书

产品详情  

产品描述

本试剂盒可以在质粒DNA序列中任意位点引入特定的定突变，包括碱基插入、碱基deletion、碱基变换等。

首先用高保真DNA聚合酶与带有突变碱基与硫代修饰的引物，PCR扩增野生型质粒，将质粒线性化并引入突变位点，然后用化学重组试剂将质粒重组成环状质粒。扩增质粒的一对引物各自5'末端的10-12个碱基互补配对，用于重组环化质粒。将带有突变碱基的线性化质粒PCR产物用化学重组试剂处理环化质粒，然后进行DH5a转化，完成基因定点突变。

本公司化学法突变试剂盒含有高保真DNA聚合酶2XPCR Mix、化学重组试剂，可以从头到尾完成整个实验，极大的方便了实验操作。另有无高保真DNA聚合酶2XPCR Mix的化学法突变试剂盒。

产品特点

DNA定点突变，包括碱基插入、碱基deletion、碱基变换等。

产品组分

使用方法

使用方法

01. 设计突变引物

引物设计总原则：在正反向扩增引物的5'端引入末端互补同源序列，使扩增后的线性化质粒片段5'和3'末端带有10-12个碱基的同源序列，用于重组环化质粒。

l 正向扩增引物设计原则：5'-末端同源序列+突变位点+硫代修饰位点+目标序列特异性正向配对序列-3'

l 反向扩增引物设计原则：5'-末端同源序列+突变位点+硫代修饰位点+目标序列特异性反向配对序列-3'

l 正／反向扩增引物与质粒模板的特异性配对序列Tm值55-65℃为佳，末端同源区序列长度为10-12 个碱基（一般情况同源区10个碱基足以）。

l 一般引物不需PAGE纯化，如果最终引物长度超过40 bp，推荐合成时选用PAGE纯化，有助于提高PCR与点突变成功率。

02. 反向PCR扩增线性化质粒，并引入突变位点

为了防止突变位点之外的碱基额外突变，确保使用高保真聚合酶进行反向PCR。50ul的PCR体系中，推荐使用1-5ng 环状质粒模板。限制性内切酶DpnI处理PCR产物，可以降低野生型质粒形成的克隆数。由于本突变试剂盒效率高，可省略DpnI消化处理，对突变成功率影响不大。

03. 重组环化反应的线性化质粒使用量

无需精确计算化学法重组反应的线性化质粒PCR产物加入量，一般使用3-5ul。

04. 质粒重组环化反应

（1）室温配制以下反应体系：

组分            重组反应^a     阴性对照^b       阳性对照^c

线性化质粒       X μl           X μl              5 μl

化学重组试剂     2 μl           0 μl              2 μl

ddH₂0         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割胶纯化的PCR产物进行重组反应时，一定在重组反应体系中加入1/10体积的化学重组Buffer

b. 用来确认野生型环状质粒残留，推荐进行。

c. 突变线性质粒DNA阳性对照反应可用来排除其他实验材料及操作因素的影响。

（2）轻柔混匀后，在70℃反应8-10 min，置于室温或冰上冷却。

u 在PCR仪及其它加热仪器上进行反应，重组环化效率在反应8-10 min左右达到最高。

u 重组环化产物可于-20℃存放1个月，待需要时解冻转化即可。

05．重组环化质粒产物转化

u 在冰上解冻克隆感受态细胞，冰上放置15min

u 取5ul重组环化产物加入到50ul感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置15-20 min。重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/5；

u 42℃水浴热激1-2min后，立即置于冰上冷却1- 2 min。

u 加入450 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌30min-1h (转速200 – 250 rpm)。

u 将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热30min（可省略）。

u 直接吸取20-100ul菌液到含有正确抗性的平板上，用无菌涂布棒涂匀。

37℃培养箱中倒置培养12 – 16 h。

06．点突变测序鉴定

u 过夜培养后，重组环化反应转化平板上形成数百个单克隆，而不加化学重组试剂的阴性对照反应转化平板上的克隆数应显著少于前者。

u 挑取重组反应转化平板上2-3个克隆进行DNA序列测定，验证是否突变成功。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作！

本产品主要用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

运输及保存方法

干冰运输。-20℃保存，有效期2年。