疫苗DNA残留对人体的潜在危害

对所使用的疫苗，我们zui关心的是疫苗的效果和其安全性。现在很多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组（CHO细胞）乙肝疫苗，Vero细胞狂犬病疫苗等大多数疫苗都是用细胞培养的方法生产，而对疫苗的纯化是关键问题，我们要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。就以疫苗DNA残留为例，疫苗DNA残留可能造成插入突变﹑导致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui终造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA残留的相关法规

由于有如此潜在的危险性，所以许多机构对疫苗DNA残留制定了相关标准，1986年世界卫生组织规定用细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过100 pg /支 ，而在1998年世界卫生组织认为细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过10 ng /支，而在1997年美国药品食品卫生监督局规定在美国使用的细胞系疫苗DNA残留不能超过10 pg /支，中国规定的细胞系疫苗DNA残留不能超过100 pg /支。

所以在疫苗生产中要随时对DNA残留进行检测，以便知道每个过程除掉DNA残留的能力。在每一批产品中我们必须检测DNA残留，所以我们必须运用敏感且行之有效的对DNA残留定量的检测方法。通常规定每支疫苗DNA残留不能超过100 pg，也就大约等同于17个甚至更少CHO细胞基因组DNA的含量，对如此微量的DNA残留进行检测，所用的技术方法就必须相当敏感和稳定，现在对DNA残留定量的方法主要有以下三种：
1、分子杂交技术检测DNA残留
2、基于DNA结合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）检测DNA残留
3、实时定量PCR法检测DNA残留

分子杂交技术检测DNA残留的原理和方法

分子杂交分析的基本原理是基于DNA探针检测变性而且固定在纤维素膜上的宿主细胞DNA。这些探针可以不依赖宿主细胞DNA来制备，例如用随机引物制备探针。探针上标记酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在4℃贮存可达两年之久，方便随时应用，所以现在常采用地高辛标记核酸探针，用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，zui后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达10pg以下（表 1  三种DNA残留检测方法的比较）。

基于DNA结合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）检测DNA残留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系统是基于两种DNA序列非特异性蛋白，单链DNA（ssDNA）结合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的单抗。检测的基本过程是当生物素—DNA单链结合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的单抗与变性的宿主细胞DNA结合zui终形成复合物，通过亲合素将此复合物连接到生物素—纤维素膜，在通过洗涤所有非特异性的被洗脱掉，zui后放于有尿素溶液的读数仪，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 导致PH值发生变化，读数仪根据PH值的变化换算成DNA的量，从而达到检测DNA残留含量的目的。

实时定量PCR法检测DNA残留的原理和方法

荧光定量PCR是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度，从而达到检测DNA残留含量的目的。

三种检测DNA残留方法的比较

3种方法用来检测疫苗DNA残留都要对样品进行相应的处理，这对zui终的结果的准确性至关重要。而杂交相对对样品DNA的损失小，而用Q-PCR需要提取样品的DNA，损失较大。在我们选择那种方法时我们要考虑它的稳定性，敏感性，成本等以至找到*的性价比的方法（表 1），从表1 我们不难发现使用分子杂交的方法是一种比较可行经济实用的方法，目前国内也主要是用此方法。

表 1  三种DNA残留检测方法的比较