用总胶原蛋白分析法分析鱼组织中的胶原蛋白
QuickZyme总胶原测定提供了一种简单快速的测定生物样品中胶原数量的方法。本应用说明为该检测方法在鱼类组织中的应用提供了指导，并显示了与HPLC的比较。
介绍
胶原蛋白是脊椎动物体内丰富的蛋白质。在鱼类（鱼）中，胶原蛋白含量约占总蛋白的3%，明显低于哺乳动物（17%）。
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胶原蛋白的含量负责鱼片的完整性和质地。
鱼类组织中羟基脯氨酸的含量与生境有关。生活在温水中的鱼类胶原体的羟脯氨酸水平高于冷水物种，而哺乳动
物中的羟脯氨酸水平甚至更高。这些羟脯氨酸水平与该物种胶原蛋白的熔化温度相关。
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鱼胶原越来越多地用于取 代传统的动物胶原来制备食品、化妆品或药用明胶。鱼胶原蛋白没有宗教反对，也没有与疯牛病相关的问题。
鱼类组织中胶原蛋白的准确分析对于食用鱼类的质量控制和优化鱼类养殖条件都具有重要意义。虽然胶原蛋白
是鱼类组织中的主要成分，但它是一种难以纯化和定量的分子。这部分是由于胶原分子通过不同类型的交联形
成广泛的网络，使得胶原分子不溶性，难以提取。
市用胶原蛋白检测的数量和类型是有限的。
一些可溶性胶原的分析存在，基于胶原分子沉淀染料天狼星红。然而，这些分析方法似乎不太适用于组织中的胶原蛋白的分析。
广泛使用的胶原蛋白测定方法是基于胶原蛋白水解为游离氨基酸，然后使用HPLC或比色法测定胶原蛋白特异性
羟脯安酸。然而，这些分析方法是费力的，耗时的，并需要特殊的设备。为了克服这些缺点，我们最近开发了
QuickZyme总胶原蛋白检测法，基于相同的酸水解和比色检测原理，但更快，更容易，不需要特殊设备。
在这个应用说明中，我们展示了该检测方法的优化，使其用于测量鱼类组织中的胶原蛋白的能力。
图1。总胶原蛋白比色法测定原理
方法
冷冻罗非鱼鱼片在当地超市获得，储存在–20ºC。在使用前，立即将鱼片解冻，并在快速酶总胶原检测试剂盒提
供的水解管中称重约300毫克的组织片。
每300mg组织中加入1.0ml6M盐酸，并将试管牢固闭合。然后，组织在95ºC的温度控制的热块中水解过夜。水解物
变得非常暗，并含有小的黑色颗粒。冷却至室温后，将水解管在13000xg下离心10min。部分颗粒不能沉淀出来。
小心地取出一部分上清液，尽可能避免转移颗粒。在4M盐酸中连续稀释水解物，稀释2–256倍。35微升的几种水
解液稀释液的样品根据说明书进行总胶原蛋白测定。
根据Bank等人的研究，我们也用HPLC方法对水解物进行了分析。
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结果
水解鱼组织的稀释曲线在低稀释时呈高度非线性，仅在16倍或以上的稀释中发现与稀释的反应呈线性关系（图2）
。这表明，水解物中含有在高浓度下干扰羟脯氨酸着色反应的物质。这种干扰在样品相当稀释时消失。为了研究
测定的回收率，在不同的水解物稀释液中加入固定数量的羟脯氨酸。低稀释（稀释2倍时10%）时羟脯氨酸的回收
率很差，但稀释16倍或以上的溶液与稀释呈线性关系。这与鱼的水解物的结果非常一致。羟脯氨酸在稀释16倍或
更高时的回收率约为120%。
图2鱼水解物稀释对总胶原蛋白测定反应的影响。蓝线：鱼水 解物，红线：鱼水解物中加入150µM羟脯氨酸(Hyp)。上面板2 至256倍稀释，下面板16至256倍稀释。从16倍稀释向下观察到 与稀释呈线性关系
快速酶总胶原蛋白检测与HPLC的比较
根据Bank等人的方法，也用HPLC分析了用于比色总胶原蛋白法测定的相同水解物
4.
简而言之：水解物通过在快速 mac真空离心机中蒸发盐酸来干燥。样品中的氨基酸用OPA衍生，去除过量的OPA，用FMOC衍生亚胺酸(Pro和Hyp)， 并在HPLC反相柱上进行多次稀释。通过比较羟脯氨酸峰面积与以同样的方法水解和衍生化的标准胶原蛋白制剂的 峰面积来确定胶原蛋白的含量。结果以每克湿罗非鱼组织的毫克胶原蛋白表达。
同样使用HPLC方法，低稀释的反应是非线性稀释。在充分稀释后，可以观察到与稀释有关的线性响应。这些稀释
液用于测定鱼组织中的胶原蛋白。
用快速酶总胶原检测发现每g湿罗非鱼组织4.5mg胶原，与HPLC法发现的每g湿组织5.1mg胶原很一致。
结论
鱼水解物含有干扰快速酶总胶原蛋白测定的因素，因为这是一个强非线性的 在低稀释因子下观察到与稀释度的关系，无论是对鱼的水解物本身和添加的羟脯氨酸。 当稀释16倍或更多时，鱼类的反应与稀释度呈线性关系 水解物和加入羟脯氨酸 水解物和羟脯氨酸的平行线指向良好的回收率和相似 这两个样本的行为。 同样，HPLC方法在低时观察到响应和稀释之间的非线性关系 稀释后，至少需要稀释64倍。 建议在试点试验中确定一个特定物种的最佳稀释度。数据 这里可以作为设计试点的指导。 快速酶总胶原分析非常适合于鱼类组织中的胶原分析使用稀释水解物。结果与标准的HPLC方法具有良好的可比性。
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