Sigma去糖基化试剂盒 使用心得

Sigma去糖基化试剂盒 使用心得

Sigma去糖基化试剂盒

Sigma-Aldrich 的天然蛋白去糖基化试剂盒(Native Protein Deglycosylation Kit,货号NDEGLY)可在天然条件下去除糖蛋白上的N连接寡糖。糖基化蛋白修饰通常位于折叠蛋白中不容易接近的位置,因此在未变性的情况下,不大可 能通过标准的肽N- 糖苷酶 F(PNGase F)处理来去除。如果您的下游分析需要折叠蛋白(如酶学分析或蛋白相互作用分析),那么这个试剂盒也许适合您。

此试剂盒包含了内糖苷酶F1、F2和F3,以及相应的反应缓冲液。与PNGase F相比,这些内糖苷酶对蛋白构象没那么敏感,更适合在蛋白未变性的情况下去除各种N连接寡糖。这三种内糖苷酶有着不同的连接特异性。F1能够去除低聚甘露 糖和混合寡糖结构,而F2和F3则分别能去除两个分支和三个分支的结构。

此试剂盒在去糖基化上的效果如何呢?美国西北大学的博士生A. Caulfield介绍了他的使用心得。

据Caulfield介绍,他们想要确定目的蛋白在去糖基化之后的生物学活性。糖基化的 去除可通过Western blot来评估,即蛋白条带的分子量减少。他们的目的蛋白包含N连接糖基化。此蛋白在HEK 293细胞中产生,并利用其N端的FLAG标签来纯化。之前他们试过PNGase,但无法让目的蛋白去糖基化。

在这一实验中,他们将2 ug目的蛋白与0.02个单位的内糖苷酶F1、F2或F3及其相应的缓冲液混合,在37°C孵育4小时。之后通过标准的SDS-PAGE和Western blot来评估去糖基化的程度。

正如他们预计的那样,蛋白被去糖基化,且各个样品之间的结果相当一致。有趣的是,内糖苷酶F1对他们的蛋白起作用,而F2和F3则*没效果。Caulfield认为,了解哪种酶能使蛋白去糖基化,将带来一些有关寡糖链性质的信息。

Caulfield认为这一试剂盒简单易用,适用于所有研究蛋白糖基化的研究人员。当然,随着蛋白底物不同,反应条件可能也需要调整。

Sigma-Aldrich提供了多种去糖基化试剂盒,包括GlycoProfile I In-Gel Deglycosylation Kit、GlycoProfile II Enzymatic In-Solution Deglycosylation Kit、GlycoProfile IV Chemical Deglycosylation Kit等,适用于溶液或PAGE胶中的糖蛋白,与下游多个分析(如质谱分析或功能研究)兼容。